Unterschied zwischen Genklonierung und PCR

Hauptunterschied - Genklonierung vs. PCR
 

Die Synthese vieler DNA-Kopien aus einem spezifischen DNA-Fragment wird als DNA-Amplifikation bezeichnet. Es gibt zwei hauptsächliche DNA-Amplifikationsverfahren, nämlich das Klonen von Genen und die PCR. Der Hauptunterschied zwischen Genklonierung und PCR ist, Genklonierung produziert die mehrfachen Kopien eines spezifischen Gens in vivo durch Konstruieren einer rekombinanten DNA und Wachsen in einem Wirtsbakterium, während die PCR Millionen von Kopien eines spezifischen DNA-Fragments produziert in vitro wiederholte Zyklen der Denaturierung und Synthese.

INHALT
1. Übersicht und Schlüsseldifferenz
2. Was ist Gene Cloning?
3. Was ist PCR?
4. Side-by-Side-Vergleich - Gene Cloning vs PCR
5. Zusammenfassung

Was ist Gene Cloning??

Die Genklonierung ist eine Technik, die zum Lokalisieren und Multiplizieren eines spezifischen Gens aus der extrahierten genomischen DNA eines Organismus durch Konstruktion von rekombinanter DNA verwendet wird. Genomische DNA enthält Tausende verschiedener Gene, die für Proteine ​​kodiert sind. Wenn DNA extrahiert wird, umfasst sie alle möglichen Gene, die sie tragen kann. Die Gen-Klonierungstechnik hat den Nachweis eines spezifischen Gens aus der Gesamt-DNA ermöglicht. Daher ist das Genklonen ein wichtiges Instrument in der Molekularbiologie.

Die Erstellung einer genomischen Bibliothek eines Organismus ist für das Klonen von Genen essentiell, wenn keine Hinweise auf die Position des relevanten Gens in der DNA vorliegen. Eine genomische Bibliothek wird mit den folgenden Schritten erstellt.

Schritt 1: Extraktion der Gesamt-DNA aus einem Organismus, der das gewünschte Gen enthält.

Schritt 2: Restriktionsverdau der extrahierten DNA, um kleine handhabbare Fragmente herzustellen. Dieser Schritt wird durch Restriktionsendonucleasen erleichtert.

Schritt 3: Auswahl eines geeigneten Vektors und Öffnen der Vektor-DNA unter Verwendung der gleichen Restriktionsendonukleasen. Bakterienplasmide werden üblicherweise als Vektoren zum Tragen fremder DNA verwendet. Plasmide sind kleine Kreise von DNA, die sich in Bakterien befinden.

Schritt 4: Kombination der Vektor-DNA und der fragmentierten DNA zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls. Dieser Schritt wird von der DNA-Ligase gesteuert.

Schritt 5: Transfer von rekombinanten DNA-Molekülen in Wirtsbakterien. Dieser Schritt wird als Umwandlung bezeichnet und erfolgt unter Verwendung eines Hitzeschocks.

Schritt 5: Screening von transformierten Bakterienzellen auf einem Kulturmedium. Am Ende des Transformationsprozesses wird eine gemischte Population von transformierten und nicht transformierten Wirtszellen erhalten. Als interessierendes Gen schließt nur in transformierten Wirtszellen ein. Daher ist es notwendig, transformierte Zellen auszuwählen. Die Auswahl erfolgt mit selektiven Medien, die Antibiotika enthalten. Nur die transformierten Zellen wachsen auf diesem Screening-Medium und ermöglichen die Selektion.

Schritt 6: Anbau von Bakterien zur Erzeugung einer Genbank. In diesem Schritt werden die transformierten Wirtszellen in frische Kulturmedien eingebracht, was optimale Wachstumsanforderungen bietet. Gesamtkolonien auf den Kulturplatten repräsentieren die genomische Bibliothek dieses Organismus.

Schritt 7: Das rekombinante DNA-Molekül, das das interessierende Gen enthält, muss aus Tausenden klonierter Fragmente rekombinanter DNA gescreent werden. Dies kann durch die Verwendung von Sonden erreicht werden, die das spezifische Gen oder die spezifischen Proteinergebnisse dieses Gens markieren.

Sobald das interessierte Gen, das die Bakterienkolonie enthält, aus den Gesamtkolonien identifiziert ist, ist es möglich, Millionen von Kopien des rekombinanten Plasmids herzustellen, das das Gen enthält.

Das Genklonieren wird zum Aufbau von Genbibliotheken verwendet, zur Herstellung von speziellen Proteinen, Vitaminen, Antibiotika, Hormonen, zur Sequenzierung und Kartierung von Genomen der Organismen, zum Erstellen mehrerer Kopien von Individuen, DNA in Forensik usw.

Figure_1: Genklonierung

Was ist PCR??

Polymerase Chain Reaction (PCR) ist eine Technik, mit der eine große Anzahl von Kopien eines bestimmten DNA-Fragments erzeugt wird. Die exponentielle Amplifikation einer spezifischen DNA-Sequenz wird durch PCR unter erhalten in vitro Bedingungen. Diese Technik ist ein sehr leistungsfähiges Werkzeug in der Molekularbiologie, da eine kleine DNA-Probe mit einer verwertbaren Menge multipliziert werden kann. Die PCR wurde 1983 von Kary Mullis eingeführt und diese preisgekrönte Erfindung brachte einen großen Fortschritt in der Molekularbiologie.

Die PCR-Technik folgt wiederholten PCR-Reaktionen, wie in Abbildung 02 gezeigt. Eine PCR-Reaktion besteht aus drei Hauptschritten, die bei drei verschiedenen Temperaturen ablaufen; Denaturierung von Doppelsträngen bei DNA bei 94 ⁰C, Anlagerung der Primer bei 68 ⁰C und Strangdehnung bei 72 ⁰Daher sollte bei der Durchführung der PCR die Temperaturschwankung für eine korrekte Replikation hoch gehalten werden. Die PCR wird in einer PCR-Maschine in PCR-Röhrchen durchgeführt. PCR-Röhrchen sind mit korrekten PCR-Gemischen gefüllt, die Template-DNA, Taq-Polymerase, Primer, dNTPs und Puffer enthalten. Die Denaturierung doppelsträngiger Proben-DNA in einzelsträngige DNA erfolgt durch Auflösen der Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen bei 94 - 98 ⁰C. Dann werden einzelne Stränge von Template-DNA für Primer freigelegt. Ein Primerpaar (vorwärts und rückwärts) sollte bereitgestellt werden, und es sollte thermostabil sein, um hohe Temperaturen zu tolerieren. Primer sind einzelsträngige kurze DNA-Sequenzen, die zu den Enden des Ziel-DNA-Fragments komplementär sind. Synthetische Primer werden in der PCR verwendet. Primer binden an die komplementären Basen der Proben-DNA und initiieren die Synthese eines neuen Strangs. Dieser Schritt wird durch ein Enzym namens Taq-Polymerase katalysiert; ein thermostabiles DNA-Polymeraseenzym, das aus isoliert wurde Thermus auqaticus. Wenn Primer und Nukleotide (Bausteine) verfügbar sind, konstruiert Taq-Polymerase den neuen DNA-Strang, der zur Template-DNA komplementär ist. Am Ende des PCR-Programms wird das amplifizierte DNA-Fragment mittels Gelelektrophorese beobachtet. Wenn eine weitere Analyse erforderlich ist, wird das PCR-Produkt aus dem Gel gereinigt.

Die PCR ist sehr nützlich für die Diagnose und Überwachung genetischer und erworbener Krankheiten, die Identifizierung von Kriminellen (auf dem Gebiet der Forensik), die Untersuchung der Struktur und Funktion eines DNA-Zielsegments, die Sequenzierung und Kartierung von Genomen von Organismen usw. Die PCR ist geworden eine routinemäßige Labortechnik in medizinischen und molekularbiologischen Forschungslabors unter Wissenschaftlern, da sie eine Vielzahl von Anwendungen findet.

Abbildung 2: Polymerase-Kettenreaktion

Was ist der Unterschied zwischen Gene Cloning und PCR??

Genklonierung vs PCR
Beim Genklonieren werden mehrere Kopien eines bestimmten Gens hergestellt in vivo durch rekombinante DNA und Umwandlung in ein Wirtsbakterium.	Die PCR-Technik erzeugt mehrere Kopien einer bestimmten DNA-Sequenz in vitro durch wiederholte Zyklen von PCR-Reaktionen.
Erfordernis der Konstruktion von rekombinanter DNA
Rekombinante DNA wird produziert, um das Gen zu lokalisieren.	Rekombinante DNA wird nicht produziert.
Bedarf an Arbeit
Dieser Prozess ist arbeitsintensiv.	Intensive Arbeit ist nicht erforderlich.
In-vivo- oder In-vitro-Prozess
Konstruktion von rekombinanter DNA ist in vitro und die Amplifikation von DNA ist in vivo.	Die Amplifikation der DNA findet vollständig statt in vitro.

Zusammenfassung - Gene Cloning vs PCR

Genklonierung und PCR sind zwei Methoden, die zur DNA-Amplifikation verwendet werden. PCR ist eine in vitro Verfahren, bei dem mehrere DNA-Kopien eines bestimmten DNA-Fragments ohne rekombinante DNA und einen Wirtsorganismus hergestellt werden. Genklonierung ist in erster Linie eine in vivo Verfahren, das durch Konstruktion rekombinanter DNA zu mehrfachen Kopien eines interessierten Gens im Wirtsorganismus führt. Dies ist der Unterschied zwischen Genklonierung und PCR.

Referenz:
1. Griffiths, Anthony JF. "Klonen eines spezifischen Gens". Moderne genetische Analyse. US National Library of Medicine, 01. Januar 1999. Web. 22. Februar 2017
2. "Polymerase Chain Reaction (PCR)". Nationales Zentrum für Biotechnologie Information. US National Library of Medicine, n. D. Netz. 22. Februar 2017

Bildhöflichkeit:
1. "Abbildung 17 01 06" Von CNX OpenStax - (CC BY 4.0) über Commons Wikimedia
2. "PCR" von Madprime - eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia