Unterschied zwischen Sanger-Sequenzierung und Pyrosequencing

Schlüsseldifferenz - Sanger-Sequenzierung vs. Pyrosequenzierung
 

Die DNA-Sequenzierung ist für die DNA-Analyse sehr wichtig, da die Kenntnis der richtigen Anordnung der Nukleotide in einem bestimmten DNA-Bereich viele wichtige Informationen darüber enthält. Es gibt verschiedene DNA-Sequenzierungsmethoden. Sanger-Sequenzierung und Pyrosequenzierung sind zwei verschiedene DNA-Sequenzierungsmethoden, die in der Molekularbiologie weit verbreitet sind. Der Hauptunterschied zwischen Sanger-Sequenzierung und Pyrosequencing besteht darin Die Sanger-Sequenzierung verwendet Didesoxynukleotide, um die DNA-Synthese zu beenden, um die Nukleotidsequenz zu lesen, während die Pyrosequenzierung die Pyrophosphat-Freisetzung nachweist, indem die Nukleotide eingebaut und die komplementäre Sequenz synthetisiert wird, um die genaue Reihenfolge der Sequenz zu lesen.

INHALT
1. Übersicht und Schlüsseldifferenz
2. Was ist Sanger-Sequenzierung?
3. Was ist Pyrosequenzierung?
4. Seite an Seite Vergleich - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
5. Zusammenfassung

Was ist Sanger-Sequenzierung??

Sanger-Sequenzierung ist eine DNA-Sequenzierungsmethode der ersten Generation, die 1977 von Frederick Sanger und seinen Colleges entwickelt wurde Kettenabbruchsequenzierung oder Didesoxy-Sequenzierung da es auf Kettenabbruch durch Didesoxynukleotide (ddNTPs) basiert. Diese Methode wurde mehr als 30 Jahre lang verwendet, bis das New Generation Sequencing (NGS) entwickelt wurde. Die Sanger-Sequenzierungstechnik ermöglichte die Entdeckung der richtigen Nucleotidordnung oder die Anlagerung eines bestimmten DNA-Fragments. Es basiert auf dem selektiven Einbau von ddNTPs und dem Abbruch der DNA - Synthese während des in vitro DNA Replikation. Das Fehlen von 3'-OH-Gruppen zur weiteren Bildung der Phosphodiesterbindung zwischen benachbarten Nukleotiden ist ein einzigartiges Merkmal von ddNTPs. Sobald das ddNTP gebunden ist, hört die Kettenverlängerung auf und endet an diesem Punkt. Es gibt vier ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP -, die bei der Sanger-Sequenzierung verwendet werden. Diese Nukleotide stoppen den DNA-Replikationsprozess, wenn sie in den wachsenden DNA-Strang eingebaut werden, und führen zu unterschiedlichen Längen kurzer DNA. Die Kapillargelelektrophorese wird verwendet, um diese kurzen DNA-Stränge nach ihrer Größe auf einem Gel zu organisieren, wie in Abbildung 01 gezeigt.

Abbildung 1: Kapillargelelektrophorese von synthetisierter kurzer DNA

Zum in vitro Replikation von DNA, sollten nur wenige Anforderungen gestellt werden. Sie sind DNA-Polymerase-Enzym, Template-DNA, Oligonukleotid-Primer und Desoxynukleotide (dNTPs). Bei der Sanger-Sequenzierung wird die DNA-Replikation in vier separaten Reagenzgläsern zusammen mit vier verschiedenen Arten von ddNTPs durchgeführt. Desoxynukleotide werden nicht vollständig durch die jeweiligen ddNTPs ersetzt. Eine Mischung aus dem jeweiligen dNTP (zum Beispiel dATP + ddATP) wird in die Röhre aufgenommen und repliziert. Vier separate Röhrchenprodukte werden in vier separaten Vertiefungen auf einem Gel laufen gelassen. Anschließend kann durch Lesen des Gels die Sequenz wie in Abbildung 02 gezeigt aufgebaut werden.

Abbildung 02: Sanger-Sequenzierung

Die Sequenzierung nach Sanger ist eine wichtige Technik, die in vielen Bereichen der Molekularbiologie hilfreich ist. Das Humangenomprojekt wurde mit Hilfe von Sanger-Sequenzierungsmethoden erfolgreich abgeschlossen. Die Sanger-Sequenzierung ist auch nützlich bei der Target-DNA-Sequenzierung, der Krebs- und genetischen Erkrankungsforschung, der Genexpressionsanalyse, der Identifizierung von Menschen, dem Nachweis von Pathogenen, der mikrobiellen Sequenzierung usw.

Die Sanger-Sequenzierung hat mehrere Nachteile:

• Die Länge der DNA, die sequenziert wird, darf nicht länger als 1000 Basenpaare sein
• Es kann jeweils nur ein Strang sequenziert werden.
• Der Prozess ist zeitaufwändig und teuer.

Daher wurden mit der Zeit neue fortschrittliche Sequenzierungstechniken entwickelt, um diese Probleme zu überwinden. Die Sanger-Sequenzierung wird jedoch aufgrund ihrer hochgenauen Ergebnisse mit Fragmenten von bis zu etwa 850 Basenpaaren immer noch verwendet.

Was ist Pyrosequenzierung??

Pyrosequencing ist eine neuartige DNA-Sequenzierungstechnik, die auf der "Sequenzierung durch Synthese" basiert. Diese Technik beruht auf dem Nachweis der Pyrophosphatfreisetzung beim Einbau des Nukleotids. Das Verfahren wird von vier verschiedenen Enzymen eingesetzt: DNA-Polymerse, ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase und zwei Substrate Adenosin-5'-phosphosulfat (APS) und Luciferin.

Der Prozess beginnt mit der Bindung des Primers an die einzelsträngige DNA-Matrize und die DNA-Polymerase beginnt mit dem Einbau von dazu komplementären Nukleotiden. Wenn sich die Nukleotide verbinden (Nukleinsäure-Polymerisation), setzen sie Pyrophosphatgruppen (zwei Phosphatgruppen, die miteinander verbunden sind) und Energie frei. Bei jeder Nukleotidzugabe wird eine äquimolare Menge Pyrophosphat freigesetzt. Pyrophosphat wandelt sich in Gegenwart von APS-Substrat durch ATP-Sulfurylase in ATP um. Das erzeugte ATP steuert die Luciferase-vermittelte Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin, wobei sichtbares Licht in Mengen erzeugt wird, die proportional zur Menge an ATPs sind. Licht wird von einem Photonendetektor oder einem Photomultiplier detektiert und erzeugt ein Pyrogramm. Apyrase baut ATP und nicht eingebaute dNTPs im Reaktionsgemisch ab. Die Zugabe von dNTP erfolgt einmalig. Da der Zusatz von Nukleotiden gemäß dem Einbau und Nachweis von Licht bekannt ist, kann die Sequenz des Templats bestimmt werden. Ein Pyrogramm wird zur Erzeugung der Nukleotidsequenz der Proben-DNA verwendet, wie in Abbildung 03 gezeigt.

Die Pyrosequenzierung ist sehr wichtig bei der Analyse von Einzelnukleotidpolymorphismen und der Sequenzierung kurzer DNA-Abschnitte. Die hohe Genauigkeit, Flexibilität, Automatisierung und Parallelverarbeitung sind die Vorteile der Pyrosequenzierung gegenüber Sanger-Sequenzierungstechniken.

Abbildung 03: Pyrosequenzierung

Was ist der Unterschied zwischen Sanger-Sequenzierung und Pyrosequencing??

Sanger-Sequenzierung vs Pyrosequenzierung
Sanger-Sequenzierung ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die auf dem selektiven Einbau von ddNTPs durch DNA-Polymerase und Kettenabbruch basiert.	Pyrosequencing ist ein DNA-Sequenzierungsverfahren, das auf dem Nachweis der Pyrophosphatfreisetzung beim Einbau von Nukleotiden basiert.
Verwendung von ddNTP
ddNTPs werden verwendet, um die DNA-Replikation zu beenden	ddNTPs werden nicht verwendet.
Enzyme beteiligt
DNA-Polymerase verwendet werden.	Es werden vier Enzyme verwendet: DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase.
Verwendete Substrate
APS und Luciferin werden nicht verwendet.	Adenosin-5'-phosphosulfat (APS) und Luciferin werden verwendet.
Maximale Temperatur
Dies ist ein langsamer Prozess.	Dies ist ein schneller Prozess.

Zusammenfassung - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Sanger-Sequenzierung und Pyrosequencing sind zwei DNA-Sequenzierungsmethoden, die in der Molekularbiologie verwendet werden. Die Sanger-Sequenzierung konstruiert die Reihenfolge der Nukleotide in der Sequenz, indem die Kettenverlängerung abgebrochen wird, während die Pyrosequenzierung die genaue Reihenfolge der Nukleotide in der Sequenz durch Einbau von Nukleotiden und Nachweis der Freisetzung von Pyrophosphaten konstruiert. Daher besteht der Hauptunterschied zwischen der Sanger-Sequenzierung und der Pyrosequenzierung darin, dass die Sanger-Sequenzierung bei der Sequenzierung durch Kettenabbruch arbeitet, während die Pyrosequenzierung bei der Sequenzierung durch Synthese arbeitet.

Referenz:
1. Fakruddin, Md und Abhijit Chowdhury. "Pyrosequenzierung - eine Alternative zur traditionellen Sanger-Sequenzierung." American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Science Publications, 02. März 2012. Web. 28. Februar 2017.
2. "Sanger-Sequenzierung". Sanger-Sequenzierung - ScienceDirect-Themen. N.p., n. D. Netz. 28. Februar 2017

Bildhöflichkeit:
1. "Didesoxy-Methode" von Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia
2. “Sanger-DNA-seq” von Enzo in der polnischsprachigen Wikipedia (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia
3. "Pyrosequenzierung" nach Mikrobiologie-Bytes (CC BY-SA 2.0) über Flickr