Unterschied zwischen RT-PCR und QPCR

Schlüsseldifferenz - RT PCR vs. QPCR
 

Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Technik, mit der eine bestimmte DNA-Region amplifiziert wird in vitro. Aufgrund der Erfindung dieser Technik durch Kary Mullis im Jahr 1983 können Wissenschaftler Tausende von Millionen spezifischer DNA-Fragmente für Forschungszwecke anfertigen. Gegenwärtig hat es sich in klinischen und Forschungslabors für eine Vielzahl von Anwendungen zu einer verbreiteten und routinemäßig durchgeführten Technik entwickelt. Es gibt Variationen traditioneller PCR-Techniken wie RT-PCR, verschachtelte PCR, Multiplex-PCR, Q-PCR, RT-QPCR usw. Die RT-PCR und die Q-PCR sind zwei wichtige Varianten der PCR. Der Hauptunterschied zwischen RT-PCR und Q-PCR ist der RT-PCR wird verwendet, um die Genexpression durch Erzeugung von zu detektierenkomplementäre DNA (cDNA) Transkripte aus RNA während Q PCR wird verwendet, um die PCR-Produkte mit Fluoreszenzfarbstoffen in Echtzeit quantitativ zu messen.

INHALT
1. Übersicht und Schlüsseldifferenz
2. Was ist RT-PCR?
3. Was ist QPCR?
4. Side-by-Side-Vergleich - RT PCR vs. QPCR
5. Zusammenfassung

Was ist RT-PCR??

Die reverse Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist eine Variante der PCR, die zum Nachweis der RNA-Expression verwendet wird. Es ist eine sehr wichtige Methode zum Nachweis der mRNA-Expression in Geweben. RT-PCR wird eingesetzt, wenn das Ausgangsmaterial der Probe RNA ist. Bei der RT-PCR wird die Template-mRNA zunächst in komplementäre DNA umgewandelt. Dieser Schritt wird durch das Enzym Reverse Transkriptase katalysiert und das Verfahren wird als reverse Transkription bezeichnet. Zweitens wird traditionelle PCR für die neu synthetisierte cDNA für die Amplifikation eingesetzt.

Die RT-PCR ist eine hochempfindliche Technik, die eine relativ kleine Menge RNA-Probe erfordert. RT-PCR wird üblicherweise zur Diagnose und Quantifizierung von RNA-Spezies verwendet, insbesondere von RNA-Viren wie dem Human Immunodeficiency Virus und dem Hepatitis-C-Virus.

Abbildung 01: RT-PCR-Technik

Was ist QPCR??

Quantitative PCR (QPCR) ist eine Variante der PCR, mit der die PCR-Produkte quantitativ gemessen werden. Sie wird auch als Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion bezeichnet, da sie die Amplifikation von Echtzeit unter Verwendung einer Echtzeit-PCR-Maschine misst. Es ist ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge einer Zielsequenz oder eines Gens, die in einer Probe vorhanden sind. Das interessante Merkmal von QPCR ist, dass es sowohl Verstärkung als auch echte Quantifizierung in einem einzigen Schritt kombiniert. Daher kann die Notwendigkeit einer Gelelektrophorese bei der Detektion durch die QPCR-Technik eliminiert werden. QPCR verwendet Fluoreszenzfarbstoffe zur Markierung von PCR-Produkten während der PCR-Reaktionen, die schließlich zu einer direkten Quantifizierung führen. Wenn sich die PCR-Produkte ansammeln, werden auch die Fluoreszenzsignale akkumuliert und von der Echtzeitmaschine gemessen. QPCR kann mit RT-PCR kombiniert werden. Es wird als RT-QPCR oder QRT-PCR bezeichnet und gilt als leistungsfähigste, empfindlichste und quantitativste Methode zum Nachweis von RNA-Spiegeln in Zellen oder Geweben.

SYBR Green und Taqman sind zwei Methoden, um den Amplifikationsprozess der Echtzeit-PCR zu erkennen oder zu überwachen. Das SYBR-Green-Verfahren wird unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs namens SYBR-Green durchgeführt und detektiert die Amplifikation durch Binden des Farbstoffs, um doppelsträngige DNA herzustellen. Taqman wird mit doppelt markierten Sonden durchgeführt und detektiert die Amplifikation durch Abbau der Sonde durch Taq-Polymerase und Freisetzung des Fluorophors wie in Abbildung 02 gezeigt. Beide Verfahren überwachen den Fortschritt des Amplifikationsprozesses und geben die Menge des Produkts in Echtzeit an.

Echtzeit-PCR hat eine breite Vielfalt von Anwendungen, wie beispielsweise Genexpressionsquantifizierung, Mikro-RNA- und nicht-kodierende RNA-Analyse, SNP-Genotypisierung, Nachweis von Kopienzahlvarianten, Nachweis seltener Mutationen, Nachweis genetisch veränderter Organismen, Nachweis von Infektionserregern usw..

Abbildung 02: Quantitative PCR-Technik

Was ist der Unterschied zwischen RT-PCR und QPCR??

RT-PCR vs. QPCR
RT-PCR ist eine Technik, die zum Nachweis der Genexpression durch Amplifikation verwendet wird.	QPCR ist eine Technik, die DNA amplifiziert und die PCR-Produkte in Echtzeit quantifiziert.
Beteiligung des Reverse Transcriptase Enzyms
Enzym-Reverse Transkriptase wird für die RT-PCR verwendet.	Enzym Reverse Transkriptase wird für QPCR nicht verwendet.
Verwendung von fluoreszenzmarkierten Molekülen
Fluoreszenzmarkierte Farbstoffe oder Sonden werden für die RT-PCR nicht verwendet.	Fluoreszenzmarkierte Farbstoffe oder Sonden werden für QPCR verwendet.
Quantifizierung des PCR-Produkts
Sofern nicht mit QPCR gekoppelt, quantifiziert RT-PCR das PCR-Produkt nicht.	QPCR misst das PCR-Produkt quantitativ.
Startmaterial
Ausgangsmaterial ist mRNA.	Ausgangsmaterial ist DNA.
Synthese von cDNA
Komplementäre DNA wird während der RT-PCR produziert.	Während der QPCR wird keine komplementäre DNA produziert.

Zusammenfassung - RT PCR vs QPCR

RT-PCR und QPCR sind zwei Versionen herkömmlicher PCR. Die RT-PCR-Technik wird für mRNA-Proben durchgeführt und wird durch reverse Transkription und Produktion von cDNA gesteuert. QPCR wird zur Quantifizierung von PCR-Produkten während der Echtzeit-PCR-Wärmezyklen mit Fluoreszenzfarbstoffen oder markierten Sonden verwendet. Im QPCR wird die Menge des PCR-Produkts durch die von der Probe emittierten Fluoreszenzsignale dargestellt. RT-PCR wird allgemein als Amplifikationsverfahren verwendet, während QPCR üblicherweise als Quantifizierungsverfahren verwendet wird. Dies ist der Unterschied zwischen RT-PCR und QPCR.

Verweise:
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2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh und Jo Vandesompele. "Unkomplizierte und sensitive RT-qPCR-basierte Genexpressionsanalyse von FFPE-Proben." Nature News. Nature Publishing Group, 22. Februar 2016. Web. 03. April 2017
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Bildhöflichkeit:
1. "Taqman" Nach Benutzer: Braindamaged - Eigene Arbeit vom ursprünglichen Uploader (Public Domain) über Commons Wikimedia
2. "Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion" Von Jpark623 - Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia