Unterschied zwischen DNA- und RNA-Extraktion

Das Hauptunterschied Zwischen DNA- und RNA-Extraktion liegt der pH-Wert von Die DNA-Extraktion liegt bei pH 8, während der pH-Wert der RNA-Extraktion bei pH 4,7 liegt. DNA neigt dazu, bei saurem pH zu denaturieren und in die organische Phase überzugehen. Bei einem alkalischen pH-Wert wird die RNA aufgrund der Anwesenheit von 2'-OH im Ribosezucker alkalisch hydrolysiert.  

DNA- und RNA-Extraktion sind die beiden Verfahren, die bei der Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren aus den Gewebezellen beteiligt sind. Beide Verfahren bestehen aus drei Schritten. DNA und RNA von guter Qualität spielen bei Molekularbiologie, Biotechnologie, Genomik und Epidemiologie eine entscheidende Rolle. 

Wichtige Bereiche 

1. Was ist DNA-Extraktion?
     - Definition, Verfahren
2. Was ist RNA-Extraktion?
     - Definition, Verfahren
3. Was sind die Ähnlichkeiten zwischen DNA- und RNA-Extraktion
     - Überblick über allgemeine Funktionen
4. Was ist der Unterschied zwischen DNA- und RNA-Extraktion
     - Vergleich der wichtigsten Unterschiede

Schlüsselbegriffe: Zelllyse, Denaturierung von Proteinen, DNA-Extraktion, pH-Wert, Fällung, RNA-Extraktion

Was ist DNA-Extraktion?

DNA-Extraktion ist das Isolierungs- und Reinigungsverfahren von DNA. DNA kann aus Blut, gefrorenen Gewebeproben oder Paraffingewebeblocks isoliert werden. Die drei Schritte der DNA-Extraktion sind Zelllyse, DNA-Isolierung und Präzipitation. Während der Zelllyse öffnen sich Zellmembranbarrieren wie Zellmembran und die Membranen des Zellkerns, um DNA freizulegen. Der nächste Schritt ist die Entfernung von Membranlipiden aus der Probe. Schließlich umfasst die Ausfällung von DNA die Entfernung von DNA-assoziierten Proteinen durch Protease und die Entfernung von RNA durch RNase.

Abbildung 1: DNA-Extraktionsverfahren

Basisprotokolle der DNA-Extraktion

Nachfolgend sind die grundlegenden Protokolle der DNA-Extraktion dargestellt. 

1. Zelllyse mit dem Zelllysepuffer, um Zellmembranen zu lysieren

2. Lipide werden mit Reinigungsmitteln und Tensiden abgebaut

3. Verdauung von Proteinen durch Zugabe von Protease

4. Verdau von RNA durch Zugabe von RNase

5. Trennung von Zelltrümmern, verdauten Proteinen, Lipiden und RNA durch Zugabe von konzentriertem Salz, gefolgt von Zentrifugation

6. Ethanolfällung von DNA mit eiskaltem Ethanol oder Isopropanol. Die Ionenstärke von Natriumacetat kann zur Verbesserung der Ausfällung verwendet werden. Die präzipitierte DNA erscheint als Fäden in der Endlösung.

Abbildung 2: Extrahierte DNA

Phenol-Chloroform-Extraktion kann auch verwendet werden, um DNA von Proteinen zu trennen. Hier denaturiert Phenol die Proteine ​​in der Probe, und die DNA bleibt am Ende der Extraktion in der wässrigen Phase. In der organischen Phase finden Sie die denaturierten Proteine. Eine andere Methode zum Extrahieren von DNA ist die Minikolonnenreinigung. Die Bindung der DNA an die Säule hängt dabei vom pH-Wert und der Salzkonzentration des Puffers ab. 

Was ist RNA-Extraktion? 

RNA-Extraktion bezieht sich auf den Prozess der Reinigung von RNA aus Proben. Die herkömmliche Methode der RNA-Extraktion wird als Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion. Guanidiniumthiocyanat denaturiert Proteine. Darüber hinaus unterbricht es die Wasserstoffbrückenbindung von Wassermolekülen und dient als chaotropes Mittel. Bei der RNA-Extraktion wird ein spezielles Reagenz verwendet, das als Tri-Reagenz. Es enthält Guanidiniumthiocyanat, Phenol und Natriumacetat. Die grundlegenden Schritte der RNA-Extraktion haben einen ähnlichen Zweck wie die DNA-Extraktion. Das Protokoll zur RNA-Extraktion ist unten beschrieben. 

1. Die Zellen werden mit eiskaltem PBS gewaschen, um die Osmolarität der Zellen aufrechtzuerhalten. 

2. Aspirieren Sie die Zellen und homogenisieren Sie die Probe mit Tri-Reagenz.  

3. Chloroform hinzufügen und schütteln. 

4. Zentrifugation kann zu drei Schichten führen. Die oberste Schicht ist die wässrige Schicht, die klar ist. Die mittlere Schicht oder die Interphase enthält die präzipitierte DNA. Die unterste Schicht ist die organische Schicht, die rosa ist. 

5. Entfernen Sie die wässrige Schicht und fügen Sie Isopropanol hinzu. Zentrifugation kann zu Pellets führen.  

6. Wasche das Pellet mit 75% Ethanol. Das Pellet an der Luft trocknen lassen. 

7. Lösen Sie das Pellet mit TE-Puffer oder Wasser.

3: Phenol-Chloroform-Extraktion von RNA

Die RNA-Extraktion wird im Allgemeinen bei einem pH-Wert unter 7 durchgeführt. Bei einem alkalischen pH-Wert neigt die RNA zum Abbau durch alkalische Hydrolyse aufgrund der Anwesenheit einer OH-Gruppe in 2'-Position des Ribosezuckers. Außerdem neigt RNA dazu, bei saurem pH-Wert in der wässrigen Phase zu bleiben. Auf der anderen Seite neigt DNA dazu, bei saurem pH-Wert zu denaturieren und in die organische Phase zu gelangen. Daher kann die DNA-Extraktion bei etwa pH 8 durchgeführt werden. Die DNA besteht aus Desoxyribosezucker und unterliegt keiner alkalischen Hydrolyse.  

Ähnlichkeiten zwischen DNA- und RNA-Extraktion 

• DNA- und RNA-Extraktion sind die Verfahren, die bei der Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren aus biologischen Proben beteiligt sind. 
• Beide Verfahren umfassen die Zelllyse, die Reinigung von Nukleinsäuren aus den Trümmern und zugehörigen Proteinen sowie die Herstellung der Extrakte. 
• Für beide Verfahren müssen durchgehend kalte Bedingungen eingehalten werden. 
• Schließt die Zentrifugation in die Trennung von Komponenten in der Mischung ein. 
• Die Aktivität von Nukleaseenzymen muss während beider Verfahren inaktiviert werden. 
• Die Phenol-Chloroform-Extraktion ist einer der entscheidenden Schritte beider Extraktionsarten. 
• Guanidiniumthiocyanat kann zum Schutz von Nukleinsäuren verwendet werden.  
• Die Ausfällung von RNA kann mit Isopropanol erfolgen. 
• Die Ionenstärke des Natriumacetats wird verwendet, um die Ausfällung von Nukleinsäuren zu verbessern.  
• Die Proben können durch Messung der OD bei 260 nm quantifiziert werden. 

Unterschied zwischen DNA- und RNA-Extraktion 

Definition 

DNA-Extraktion: Verfahren zur Isolierung und Reinigung von DNA

RNA-Extraktion: Verfahren zur Reinigung von RNA aus Proben

Typ der extrahierten Nukleinsäure 

DNA-Extraktion: DNA 

RNA-Extraktion: RNA 

pH-Wert 

DNA-Extraktion: Geschehen zu 8 

RNA-Extraktion: Geschehen zu 4.7 

Schritte 

DNA-Extraktion: Brechen der Zellmembranen oder Zelllyse, Entfernen der Membranlipide und Ausfällen der DNA 

RNA-Extraktion: Zelllyse, Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion, Herstellung mit Isopropanol 

Verwendung von DEPC-behandeltem Wasser 

DNA-Extraktion: Keiner 

RNA-Extraktion: Alle Reagenzien werden mit DEPC-behandeltem Wasser hergestellt

Lager 

DNA-Extraktion: DNA kann vorher extrahiert werden und wird in Chargen gespeichert

RNA-Extraktion: Die RNA-Extraktion wird kurz vor den nachfolgenden Verfahren durchgeführt

Langzeitlagerung 

DNA-Extraktion: Bei -20 ° C

RNA-Extraktion: Bei -80 ° C 

Fazit 

Die DNA-Extraktion wird bei pH 8 durchgeführt. DNA neigt dazu, sich in die organische Phase zu bewegen, während sie bei saurem pH denaturiert. Die RNA-Extraktion wird jedoch bei niedrigem pH-Wert durchgeführt, um den Abbau durch alkalische Hydrolyse zu verhindern. Der grundlegende Zweck der Schritte der DNA- und RNA-Extraktion ist ähnlich. Der Hauptunterschied zwischen DNA- und RNA-Extraktion liegt in den pH-Bedingungen, die bei jeder Extraktionsart verwendet werden. 

Referenz:

1. "Grundlagen der DNA-Extraktion". Alaska BioPREP Virtuelles Lehrbuch, Alaska BioPREP Universität Alaska Fairbanks, hier erhältlich
2. "RNA-Isolierungs- und Reverse-Transkriptionsprotokoll: Zellen in Kultur". Abcam, hier erhältlich

Bildhöflichkeit:

1. "Abbildung 17 01 02" von CNX OpenStax - (CC BY 4.0) über Commons Wikimedia  
2. "DNA-Extraktion" von Joo Nath - Eigene Arbeit (CC BY-SA 4.0) über Commons Wikimedia  
3. "PhOH-CHCl3-Extraktion" Von Squidonius (Diskussion) - Eigene Arbeit (Originaltext: selbst erstellt) (Public Domain) über Commons Wikimedia