Unterschied zwischen der Umkehrphase und der hydrophoben Interaktionschromatographie

Das Hauptunterschied zwischen Umkehrphasen- und hydrophober Interaktionschromatographie ist das Umkehrphasenchromatographie (RPC) verwendet ein stärker hydrophobes Medium, das zu stärkeren Wechselwirkungen führt, während die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) im Vergleich zu dem Medium in der Umkehrphasenchromatographie ein weniger hydrophobes Medium verwendet.  

Umkehrphasenchromatographie und hydrophobe Interaktionschromatographie sind zwei chromatographische Techniken, die von den Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Oberflächen eines Chromatographiemediums und den hydrophoben Flecken auf der Oberfläche von Biomolekülen abhängen.

Wichtige Bereiche

1. Was ist Umkehrphasenchromatographie
     - Definition, Schritte, Anwendungen
2. Was ist die hydrophobe Interaktionschromatographie?
     - Definition, Schritte, Anwendungen
3. Was sind die Gemeinsamkeiten zwischen Umkehrphasenchromatographie und hydrophober Interaktionschromatographie
     - Überblick über allgemeine Funktionen
4. Was ist der Unterschied zwischen der Umkehrphasenchromatographie und der hydrophoben Interaktionschromatographie
     - Vergleich der wichtigsten Unterschiede

Schlüsselbegriffe

Hydrophobe Interaktionschromatographie, HIC, Medien, Umkehrphasenchromatographie, RPC

Was ist Umkehrphasenchromatographie

Die Umkehrphasenchromatographie (Reverse Phase Chromatography, RPC) ist eine chromatographische Technik, die bei der Reinigung und Analyse von Biomolekülen wie Proteinen, Peptiden und Oligonukleotiden verwendet wird. Es liefert eine hochauflösende Trennung und ist ideal für die Peptidkartierung und Reinheitsprüfung. RPC wird häufiger beim abschließenden Polieren von Peptiden und Oligonukleotiden verwendet.

Als stationäre Phase können zwei Haupttypen von hydrophoben Medien verwendet werden: mit Kohlenstoffketten bedeckte Silicakügelchen oder nackte hydrophobe Polymere. Eine Säule wird mit den hydrophoben Medien in Form eines Füllbettes gefüllt, auf das die Probe aufgebracht wird. Ein Ionenpaarungsmittel wie Trifluoressigsäure (TFA) kann der mobilen Phase zugesetzt werden, um die Bildung von hydrophoben Wechselwirkungen zu verstärken. Zu Beginn wird ein organisches Modifizierungsmittel wie 5% Acetonitril verwendet, und die Elution kann mit der Erhöhung des Prozentsatzes von Acetonitril eingeleitet werden.

Abbildung 1: Umkehrphasenchromatographie-Theorie

Biomoleküle, die weniger hydrophob / polarer sind, werden zuerst eluiert, während die hydrophoberen Moleküle später eluieren. RPC ist die chromatographische Technik mit der höchsten Auflösung.

Was ist die hydrophobe Interaktionschromatographie?

Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ist die andere Technik, die bei der Trennung von Biomolekülen basierend auf der Hydrophobie unter moderaten Bedingungen verwendet wird. Es ist eine ideale Technik für die Reinigung von Proteinen, wenn die Proben einer Ammoniumsulfatfällung in der anfänglichen Probenkonzentration und Reinigung unterzogen werden müssen. Der erhöhte Salzgehalt während der Ammoniumsulfatfällung erhöht die Wechselwirkung zwischen hydrophoben Komponenten.

Abbildung 2: Einfluss einer hohen Salzkonzentration auf hydrophobe Wechselwirkungen

Das hydrophobe Medium von HIC besteht aus einer inerten Matrix aus kugelförmigen Teilchen, die mit Liganden beschichtet sind, die Alkyl- oder Arylgruppen enthalten. Die hydrophoben Wechselwirkungen treten bei mäßig hohen Salzkonzentrationen auf (typischerweise 1-2 M Ammoniumsulfat oder 3 M NaCl). Der Startpuffer gewährleistet die Bindung von interessierenden Proteinen an das Medium, während die Verunreinigungen weggespült werden. Der Elutionspuffer enthält eine niedrige Salzkonzentration, wodurch die Wechselwirkung zwischen Proteinen und der stationären Phase geschwächt wird.

Ähnlichkeiten zwischen Umkehrphasenchromatographie und hydrophober Interaktionschromatographie

• Umkehrphasen- und hydrophobe Interaktionschromatographie sind zwei Techniken, die bei der Trennung von Biomolekülen basierend auf ihrer Hydrophobizität verwendet werden.
• Die mobile Phase beider Techniken ist entweder Wasser oder ein organisches Lösungsmittel.
• Sie verwenden gepackte Bettsäulen.
• Startpuffer stellt die Bindung der gewünschten Moleküle an die Säule sicher.
• Moleküle mit der geringsten Hydrophobizität können zuerst eluiert werden, während hydrophobere Moleküle später eluieren können.
• Der letzte Waschschritt eluiert die am dichtesten gebundenen Moleküle.
• Die Auflösung beider Techniken ist eine Kombination aus der Selektivität (Trennungsgrad zwischen den Peaks), der Effizienz (der Fähigkeit, enge, symmetrische Peaks zu erzeugen) der Technik, der Masse der Probe und der Retentionszeit.

Unterschied zwischen Umkehrphasenchromatographie und hydrophober Interaktionschromatographie

Definition

Umkehrphasenchromatographie (RPC) bezieht sich auf die Trenntechnik mit der höchsten Auflösung, die auf der Hydrophobie der Moleküle in einem Gemisch basiert, während sich die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) auf eine Art von Trennmethode bezieht, die auf der Hydrophobie basiert, jedoch unter relativ milden Bedingungen arbeitet.

Hydrophobie

Der RPC arbeitet unter hydrophoberen Bedingungen, während der HIC unter relativ milden hydrophoben Bedingungen arbeitet.

Wechselwirkungen

Umkehrphasenchromatographie führt zu stärkeren Wechselwirkungen zwischen Molekülen und der stationären Phase, die während der Elution durch einen organischen Modifikator umgekehrt werden müssen, während HIC zu mäßig hohen Wechselwirkungen zwischen der stationären Phase und den Molekülen führt.

Hydrophobe Medien

RPC verwendet entweder mit Kohlenstoffketten bedeckte Silicakügelchen oder nackte hydrophobe Polymere, während HIC eine inerte Matrix aus kugelförmigen Teilchen verwendet, die mit Liganden beschichtet sind, die Alkyl- oder Arylgruppen enthalten.

Puffer starten

Der Startpuffer in RPC verwendet Trifluoressigsäure (TFA), während der Startpuffer von HIC mäßig hohe Salzkonzentrationen verwendet.

Elution

Der erhöhte Prozentsatz an Acetonitril beginnt mit der Elution in RPC, während die abnehmende Salzkonzentration mit der Elution in HIC beginnt.  

Auflösung

Die Umkehrphasenchromatographie ist die chromatographische Technik mit der höchsten Auflösung, während die Auflösung der HIC im Vergleich zu RPC niedrig ist.

Anwendungen

RPC wird zur Trennung von Proteinen, Peptiden und Oligonukleotiden verwendet, während HIC hauptsächlich zur Reinigung von Proteinen verwendet wird.

Fazit

Die Umkehrphasenchromatographie ist die chromatographische Technik mit der höchsten Auflösung, die unter stark hydrophoben Bedingungen arbeitet. HIC arbeitet jedoch unter moderaten hydrophoben Bedingungen. RPC und HIC sind die zwei Arten von Trenntechniken, die auf der Hydrophobie basieren. Der Hauptunterschied zwischen RPC und HIC ist der Grad der Hydrophobie, der bei jeder Technik verwendet wird.

Referenz:

1. Hydrophobe Interaktion und Umkehrphasenchromatographie: Prinzipien und Methoden. GE Healthcare, 2006. Hier erhältlich

Bildhöflichkeit:

1. "Umkehrphasengradienten-Elutionsschema" von Nategm - Eigene Arbeit (CC BY-SA 4.0) über Commons Wikimedia   
2. “Hicsalt” von Daliak in English Wikibooks - übertragen von en.wikibooks an Commons. (Public Domain) über Commons Wikimedia