Wie helfen Fluoreszenzmarker bei der Bestimmung einer Nukleotidsequenz?

DNA-Sequenzierung ist eine Technik, mit deren Hilfe die Nukleotidsequenz eines bestimmten DNA-Moleküls bestimmt werden kann. Die zwei Sequenzierungsmethoden sind Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung. Beide Arten von Sequenzierungsmethoden sind auf dem neuesten Stand vollständig automatisiert. Jeder DNA-Strang besteht aus den vier Nukleotiden: Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Die Nukleotide im DNA-Fragment sind in beiden Arten von Sequenzierungsverfahren mit vier separaten fluoreszierenden Markern markiert. Die fluoreszierenden Marker oder Fluorophore sind Moleküle, die Licht absorbieren und bei einer definierten Wellenlänge emittieren können. Die Fluoreszenzmarker werden durch PCR in den DNA-Strang eingebaut. Dann wird die Sequenz der Nukleotide durch automatisierte Techniken bestimmt.

Wichtige Bereiche

1. Was ist Sequenzierung?
     - Definition, Sanger-Sequenzierung, Next-Generation-Sequenzierung
2. Wie helfen Fluoreszenzmarker bei der Bestimmung einer Nukleotidsequenz?
     - Sequenzierungsverfahren

Schlüsselbegriffe: Dideoxynukleotide (ddNTPs), Fluoreszenzmarker, Gelelektrophorese, Next-Generation-Sequenzierung, Nukleotidsequenz, PCR, Sanger-Sequenzierung

Was ist Sequenzierung?

Die Sequenzierung ist eine Labortechnik, mit der die Nukleotidsequenz eines DNA-Moleküls bestimmt wird. Zwei Hauptarten von DNA-Sequenzierungsmethoden können als Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung identifiziert werden. Sowohl die Sanger-Sequenzierung als auch die Next-Generation-Sequenzierung verwenden markierte Nukleotide mit Fluoreszenz zur Bestimmung der Nukleotidsequenz.

Sanger-Sequenzierung

Die Sanger-Sequenzierung ist die erste entwickelte Methode zur DNA-Sequenzierung. Die Sequenzierungsmethode wurde zuerst von Fredric Sanger im Jahr 1975 entwickelt. Daher ist sie als Sanger-Sequenzierung bekannt. Die Methode der Sanger-Sequenzierung ist auch bekannt als Kettenabbruchmethode da es am selektiven Einbau von kettenabbrechenden Didesoxynukleotiden (ddNTPS) durch DNA-Polymerase beteiligt ist in vitro DNA-Synthese. Die Verlängerung des DNA-Strangs wird durch die regulären Desoxynukleotide (dNTPs) erreicht. Dem Reaktionsgemisch werden jedoch ddNTPs zugesetzt, um das Kettenwachstum zu beenden. Diese ddNTPs sind fluoreszenzmarkiert. Die vier Arten von ddNTPs werden vier separaten PCR-Gemischen hinzugefügt. Daher werden vier separate PCR-Reaktionen durch Hinzufügen von ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP durchgeführt. In jedem Reaktionsgemisch ist das Kettenwachstum jeweils an den A-, G-, C- und T-Nukleotiden beendet. Zum Beispiel wird in der Reaktionsmischung mit zugesetztem ddATP das Wachstum verschiedener Amplicons an jedem A-Nukleotid im DNA-Fragment beendet. Dann werden diese vier Reaktionen durch Gelelektrophorese getrennt und ein Fluorometer wird verwendet, um die getrennte Fluoreszenz abzusuchen. Die Sanger-Sequenzierung wird häufig zur Bestimmung der Sequenz der bei der DNA-Klonierung verwendeten Fragmente und der durch PCR amplifizierten Fragmente verwendet. Die bestimmten Nukleotidsequenzen sind in gezeigt Abbildung 1.

Abbildung 1: DNA-Sequenzen

Next-Generation Sequencing

Die neuesten DNA-Sequenzierungstechnologien sind als Sequenzierung der nächsten Generation bekannt. Die Sequenzierungsreaktionen werden gleichzeitig im Mikromaßstab auf einem Chip durchgeführt. Daher werden mehrere Sequenzierungsreaktionen parallel durchgeführt. Bei der Sequenzierung der nächsten Generation wird die Kapillarelektrophorese zusätzlich zur Gelelektrophorese zur Trennung von Amliconen mit verschiedenen Längen verwendet, die durch Kettenabbruchverfahren erzeugt werden. Die Kapillarelektrophorese ist eine analytische Trennmethode, bei der Moleküle aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilität getrennt werden.

Wie helfen fluoreszierende Hersteller dabei, eine Nukleotidsequenz zu bestimmen?

Während der Sequenzierung dient die zu sequenzierende DNA als Matrizenstrang für die DNA-Synthese durch PCR. Ein DNA-Primer wird zur Initiierung der DNA-Synthese durch DNA-Polymerase verwendet. Eine Mischung aus vier regulären Basen (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) und einem geringen Anteil eines der vier Didesoxynukleotide (ddNTPs; ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP) wird als Komponenten der PCR-Reaktion zugegeben. Daher werden vier individuelle PCR-Reaktionen durch Hinzufügen jedes der vier ddNTPs durchgeführt. Didesoxynukleotide besitzen zwei besondere Eigenschaften:

1. Ihnen fehlt die 3'-OH-Gruppe, zu der das ankommende Nukleotid durch DNA-Polymerase hinzugefügt wird. Daher beendet der Einbau des ddNTP das Kettenwachstum.
2. Sie sind mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert: die ddATP ist mit einem grünen Farbstoff markiert, das ddGTP ist mit einem gelben Farbstoff markiert, das ddCTP ist blau gekennzeichnet, und das ddTTP ist mit rotem Farbstoff markiert.

Die Kettenabbruch-ddNTPs werden jedoch in geringen Konzentrationen zugegeben; Sie beenden den gesamten PCR-Prozess nicht sofort. Wenn jedoch einer der vier ddNTPs in die wachsende Kette eingebaut wird, wird dieses bestimmte Kettenwachstum beendet. Deshalb, Am Ende von jeweils vier PCR-Reaktionen werden eine Reihe von Amplicons (die durch PCR erhaltenen DNA-Fragmente) hergestellt, die terminiert werden an jedem Nukleotid des Ziel-DNA-Fragments. Diese Amplikons können in einem Gel laufen gelassen werden. Die Fluoreszenzfarbstoffe, die an einem definierten Punkt des elektrophoretischen Gels vorbeigehen, können mit einem Fluorometer abgetastet werden, um die Nukleotidsequenz in den automatisierten DNA-Sequenzierern zu bestimmen. Die fluoreszenzmarkierte Nukleotidsequenz, die bei der DNA-Sequenzierung erhalten wurde, ist in gezeigt Figur 2.

2: Fluoreszenzmarkierte Nukleotidsequenz

Durch Kombinieren jedes der Nukleotide in der Reihe kann die Nukleotidsequenz des anfänglichen DNA-Fragments bestimmt werden. Die Nukleotidsequenz eines Fragments mit 750-1.000 Basenpaaren kann leicht durch Lauf nach Sanger-Sequenzierung bestimmt werden. Die Sequenzierung eines ganzen Genoms bleibt jedoch aufgrund der Anwesenheit einer großen Anzahl von Nukleotiden immer noch schwierig. 454-Sequenzierung ist eine Art Sequenzierung der nächsten Generation, mit der 20 Millionen Basenpaare pro Einzellauf gelesen werden können.

Fazit

Sequenzierung ist eine Technik, die zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines bestimmten DNA-Fragments verwendet wird. Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung sind die beiden wichtigsten Sequenziertechnologien. Beide Technologien verwenden Fluoreszenzmarker zur Bestimmung der Nukleotidsequenz. Jedes der vier kettenabbrechenden Didesoxynukleotide ist mit vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und wird in vier separaten PCR-Reaktionen verwendet, um die Sequenz zu erhalten.

Referenz:

1. Adams, Jill U. "DNA Sequencing Technologies". Nature News, Nature Publishing Group, erhältlich hier.
2. Carr, Steven M. Fluoreszenzsequenzierung, hier erhältlich.
3. „DNA-Sequenzierung - Automatisierte Sequenzierung mit Fluoreszenzfarbstoffen.“ JRank-Artikel, hier erhältlich.

Bildhöflichkeit:

1. “Alineando secuencias (2)” von Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) über Flickr
2. "Radioactive Fluorescent Seq" Von Abizar in der Wikipedia auf Englisch (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia