Wie funktioniert die DNA-Sequenzierung?

Sequenzierung ist der Prozess, der bei der Bestimmung einer Nukleotidsequenz eines bestimmten DNA-Fragments involviert ist. Während der Sequenzierung wird das DNA-Fragment mittels PCR terminal mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden markiert. Bei diesem Verfahren werden vier Arten von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden verwendet, bei denen es sich um Didesoxynukleotide (ddNTPs) handelt. ddNTPs haben keine 3'-OH-Gruppe, an die die Phosphatgruppe des ankommenden Nukleotids gebunden ist. Wenn daher ein ddNTP an die wachsende Kette angehängt wird, erfolgt keine weitere Zugabe von Nukleotiden am 3'-Ende der Kette. Das heißt, die Zugabe eines ddNTP in die wachsende Kette beendet das Kettenwachstum. Da ddNTPs in geringen Konzentrationen zu der PCR-Mischung gegeben werden, ist jede Wachstumskette auf verschiedenen Ebenen terminiert. Die emittierende Fluoreszenz wird nachgewiesen, um die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments am Ende der PCR zu bestimmen.

Wichtige Bereiche

1. Was ist DNA-Sequenzierung?
     - Definition, Typen
2. Wie funktioniert die DNA-Sequenzierung?
     - Prozess der DNA-Sequenzierung

Schlüsselbegriffe: Dideoxynukleotide (ddNTPs), Fluoreszenzmarker, Gelelektrophorese, Next-Generation-Sequenzierung, Nukleotidsequenz, PCR, Sanger-Sequenzierung

Was ist DNA-Sequenzierung? 

DNA-Sequenzierung ist eine Labortechnik, die zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines bestimmten DNA-Moleküls verwendet wird. Es verwendet fluoreszenzmarkierte Nukleotide, die während der PCR eingebaut werden. Es gibt zwei Hauptverfahren für die Sequenzierung, die auf den beim Nachweis der Fluoreszenz verwendeten Techniken basieren: Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung.

Sanger-Sequenzierung

Die Sanger-Sequenzierung, die 1975 von Fredric Sanger entwickelt wurde, ist die erste entwickelte Sequenzierungsmethode. Es ist auch bekannt als Kettenabbruchmethode schon seit Es ist am selektiven Einbau von kettenabbrechenden ddNTPs während beteiligt in vitro DNA-Synthese. Bei der Sanger-Sequenzierung werden Amplikons durch Gelelektrophorese getrennt. Die Sanger-Sequenzierung wird häufig zur Bestimmung der Sequenz der bei der Klonierung verwendeten DNA-Fragmente und der durch PCR amplifizierten Fragmente verwendet. Eine bestimmte DNA-Sequenz ist in gezeigt Abbildung 1.

Abbildung 1: DNA-Sequenzierung

Next-Generation Sequencing

Die neuesten DNA-Sequenzierungstechnologien sind als Sequenzierung der nächsten Generation bekannt. Es ist auch eine Kettenabbruchmethode. Die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet die Kapillarelektrophorese zur Trennung von Amplikonen mit verschiedenen Längen, die durch Kettenabbruchverfahren erzeugt werden. Die Sequenzierung der nächsten Generation wird bei der Bestimmung einer großen Anzahl von Nukleotiden pro Lauf verwendet, beispielsweise bei der Genomsequenzierung.

Wie funktioniert die DNA-Sequenzierung?

Während der DNA-Sequenzierung werden fluoreszenzmarkierte Nukleotide durch PCR zu einem bestimmten DNA-Fragment hinzugefügt. Zur Verlängerung des DNA-Strangs werden reguläre Desoxynukleotide (dNTPs) verwendet. Dem Reaktionsgemisch, das fluoreszenzmarkiert ist, werden jedoch ddNTPs zugesetzt. Da ddNTPs keine 3'-OH-Gruppe im Desoxyribose-Zuckermolekül aufweisen, kann kein weiteres Kettenwachstum auftreten, wodurch das Kettenwachstum abgebrochen wird. Das Zuckerphosphat-Rückgrat der DNA wird durch die Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen der 3'-OH-Gruppe des Desoxyribose-Zuckers und der Phosphatgruppe des eingehenden Nukleotids gebildet. DdNTPs werden jedoch in geringen Konzentrationen zugegeben; Daher beenden sie das Kettenwachstum nicht sofort.

Zu vier separaten PCR-Gemischen werden vier Arten von ddNTPs hinzugefügt. Vier separate PCR-Reaktionen werden durch Zugabe von ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP durchgeführt. Daher ist in jeder Reaktionsmischung das Kettenwachstum bei A-, G-, C- und T-Nukleotiden beendet. Zum Beispiel wird in der Reaktionsmischung mit zugesetztem ddATP das Wachstum verschiedener Amplicons an jedem A-Nukleotid im DNA-Fragment beendet. Die Bestimmung der DNA-Sequenz durch Sanger-Sequenzierung ist in gezeigt Figur 2.

Abbildung 2: Sanger-Sequenzierung

Jeder der vier Typen von Nukleotiden wird durch separate Fluoreszenzfarbe markiert; das ddATP ist mit grünem Farbstoff markiert. das ddGTP ist mit gelbem Farbstoff markiert; das ddCTP ist mit blau markiert; das ddTTP ist mit rotem Farbstoff markiert. Daher sind die Amplikons der vier PCR-Reaktionen in separaten Farben markiert.

Nach der Amplifikation des interessierten DNA-Fragments werden die Amplikons entweder durch Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese getrennt. Die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments kann durch den Nachweis der emittierenden Fluoreszenz bestimmt werden. Die Nukleotidsequenz von 750-1.000 Basenpaaren langen Fragmenten kann leicht durch Lauf nach Sanger-Sequenzierung bestimmt werden. Die Bestimmung der Nukleotidsequenz eines ganzen Genoms bleibt jedoch aufgrund einer großen Anzahl von Nukleotiden in Genomen schwierig. Bei der nächsten Generation von Sequenzierungstechniken, wie etwa der 454-Sequenzierung, können etwa 20 Millionen Basenpaare pro Einzellauf gelesen werden.

Fazit

DNA-Sequenzierung ist ein molekularbiologisches Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz von DNA-Fragmenten. Während der Sequenzierung werden fluoreszenzmarkierte Nukleotide durch PCR zu den DNA-Fragmenten hinzugefügt. Durch Detektion der emittierenden Fluoreszenz kann die Nukleotidsequenz bestimmt werden.

Referenz:

1. "DNA-Sequenzierung". Khan Akademie, Hier verfügbar.

Bildhöflichkeit:

1. "DNA-Sequenz" von Sjef - Eigene Arbeit, Public Domain) über Commons Wikimedia
2. „Didesoxy-Methode“ von Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia