Wie funktioniert die Illumina-Sequenzierung?

Illumina Sequencing ist eine Sequenzierungsmethode der nächsten Generation, die auch alsSequenzierung durch Synthese" Methode. Die Illumina-Sequenzierung ist an der parallelen Verarbeitung von Millionen von Fragmenten beteiligt. Die vier grundlegenden Schritte des Illumina-Sequenzierungsworkflows umfassen die Bibliotheksvorbereitung, die Clustergenerierung, die Sequenzierung und die Datenanalyse, die in diesem Artikel näher beschrieben werden.

Wichtige Bereiche

1. Was ist Illumina Sequencing?
     - Definition, Fakten, Vorteile
2. Wie funktioniert die Illumina-Sequenzierung?
     - Prozess der Illumina-Sequenzierung:
          - Bibliotheksvorbereitung
          - Cluster-Generierung
          - Sequenzierung
          - Datenanalyse

Schlüsselbegriffe: Cluster-Generierung, Datenanalyse, Illumina-Sequenzierung, Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung durch Synthese

Was ist Illumina Sequencing?

Die Illumina-Sequenzierungs- oder Sequenzierungs-durch-Synthese-Technologie (SBS) ist die weltweit am häufigsten verwendete Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation. Mehr als 90% der Sequenzierungsdaten der Welt werden durch Illumina-Sequenzierung generiert. Es wurde ursprünglich von Shankar Balasubramanian und David Klenerman an der University of Cambridge entwickelt. Sie gründeten 1998 ein Unternehmen namens Solexa. Im Jahr 2007 kaufte Illumina Solexa, wodurch die ursprüngliche Technologie rasch verbessert wurde. Daher wird die Methode auch aufgerufen Solexa / Illumina-Sequenzierungsverfahren. Der Hauptvorteil der Illumina-Sequenzierung ist, dass sie eine hohe Ausbeute fehlerfreier Lesevorgänge liefert.

Wie funktioniert die Illumina-Sequenzierung?

Die vier Schritte der Illumina-Sequenzierung sind unten beschrieben.

Schritt 1. Bibliotheksvorbereitung

• Eine Sequenzierungsbibliothek wird gleichzeitig erstellt Tagmentation von DNA in kurze Segmente von 200-600 Basenpaaren durch Transposasen in einem als Tagmentation bekannten Prozess, gefolgt von der Ligation des Adapters in sowohl das 3'- als auch das 5'-Ende der kurzen DNA-Segmente.
• Zusätzliche Motive wie Sequenzierungs-Primer-Bindungsstelle, Index und eine Region, die komplementär zum Flusszell-Oligo ist, werden dem Adapter auf beiden Seiten hinzugefügt reduzierte Zyklusverstärkung. Tagmentation und Hinzufügen von Motiven sind in dargestellt Abbildung 1.

Abbildung 1: Kennzeichnung und Addition von Motiven

Schritt 2. Clustergenerierung

• Die vorbereitete Sequenzierungsbibliothek wird denaturiert und in a geladen Fließzelle zur Clustergenerierung. Während der Clustererzeugung wird jedes Fragment in der Sequenzierungsbibliothek isotherm verstärkt. Die Durchflusszelle besteht aus glashaltigen Bahnen. Jede Bahn ist mit zwei Arten von Oligonukleotiden beschichtet. Ein Typ ist komplementär zum 5'-Bereich der zusätzlichen Motive und der andere Typ ist komplementär zum 3'-Bereich der zusätzlichen Motive der hergestellten Bibliothek. Daher binden diese Oligos an die entsprechenden DNA-Regionen in der Sequenzierungsbibliothek. Die Durchflusszelle mit zwei Arten von Oligos ist in gezeigt Figur 2. Das Oligo, das an die 5'-Region der Sequenzierungsbibliothek bindet, hat eine rosa Farbe, während das Oligo, das an die 3'-Region der Sequenzierungsbibliothek bindet, eine grüne Farbe hat.

Abbildung 2: Flusszelle

• Sobald die einzelsträngige Sequenzierungsbibliothek an das Oligo gebunden ist, wird der komplementäre Strang durch DNA-Polymerase erzeugt. Dann wird die resultierende doppelsträngige DNA denaturiert und der ursprüngliche Strang wird weggespült.
• Das klonale Verstärkung des Fragments wird durch erreicht Brückenverstärkung. Während dieses Vorgangs faltet sich der Strang über der zweiten Art von Oligo auf der Fließzelle. Dann synthetisiert die Polymerase die doppelsträngige Brücke. Die Denaturierung der Brücke führt zu zwei DNA-Strängen: Vorwärts- und Rückwärtsstrang auf den Oligos der Fließzelle.
• Die Brückenamplifikation wird immer wieder wiederholt, um durch Klonamplifikation gleichzeitig Millionen von Clustern aller Fragmenttypen in der Sequenzierungsbibliothek zu erhalten. Die klonale Verstärkung ist in gezeigt Figur 3.

Abbildung 3: Klonale Verstärkung

• Dann werden die umgekehrten Stränge weggespült, wobei nur die vorderen Stränge auf der Fließzelle verbleiben. Im Vorwärtsstrang ist das 3'-Ende frei und es ist blockiert, um ein unerwünschtes Priming zu verhindern.

Schritt 3. Sequenzierung

Erstes Lesen der umgekehrten Sequenz

• Die Sequenzierung beginnt mit dem Erweiterung des ersten Sequenzierprimers. Das Illumina-Sequenzierungsverfahren verwendet modifizierte dNTPs, die einen Terminator an der 3'-Position des Desoxyribose-Zuckers enthalten. Diese dNTPs sind auch in verschiedenen Farben fluoreszenzmarkiert.

• Nach der Zugabe jedes komplementären Nukleotids werden die Cluster in der Durchflusszelle auf die Emission von Fluoreszenz beobachtet.

• Nach dem Nachweis von Licht kann der Fluorophor abgewaschen werden.

• Dann wird die Terminatorgruppe der 3'-Position des Zuckers durch eine Hydroxylgruppe regeneriert, wodurch die Zugabe eines zweiten dNTP zur wachsenden Kette ermöglicht wird. Dieser Vorgang ist als Sequenzierung durch Synthese bekannt. Die Sequenzierung durch Synthese ist in gezeigt Figur 4.

Abbildung 4: Sequenzierung durch Synthese

• Am Ende der Synthese wurde die Erstes Lesen der umgekehrten Reihenfolge wird erhalten und das Sequenzierungsprodukt wird weggespült.

Index 1 Lesen

• Der Index 1-Primer wird dann an Cluster hybridisiert, um auf dieselbe Weise durch Sequenzierung durch Synthese einen zweiten Lesevorgang zu erzeugen. Das Sequenzierungsprodukt wird weggespült.

Index 2 Lesen

• Das 3'-Ende des Clusters wird dann entschützt, wodurch die Hybridisierung des 3'-Endes mit der zweiten Art von Oligo an der Fließzelle (grüne Farbe) ermöglicht wird. Dadurch wird die Sequenz der Index 2-Region erhalten. Das Sequenzierungsprodukt wird weggespült.

Zweites Lesen der Vorwärtssequenz

• Die zweite Art von Oligo wird durch eine Polymerase verlängert und bildet eine doppelsträngige Brücke. Die Brücke ist denaturiert und ihre 3'-Enden sind blockiert. Der Vorwärtsstrang wird weggespült.
• Das zweites Lesen der Vorwärtssequenz wird durch Sequenzierung durch Synthese durch Hybridisierung und Verlängerung des zweiten Sequenzierungsprimers erhalten.

Schritt 4. Datenanalyse

• Die Milliarden von Lesevorgängen, die durch Sequenzierung erhalten werden, werden nach ihren Indexsequenzen gruppiert.
• Dann werden die Sequenzen mit ähnlichen Lesevorgängen gruppiert.
• Vorwärts- und Rückwärtslesungen werden gepaart, um zusammenhängende Sequenzen zu bilden.
• Die mehrdeutigen Ausrichtungen können durch gepaarte Sequenzen aufgelöst werden.
• Die angrenzenden Sequenzen werden zur Variantenidentifizierung an das Referenzgenom angepasst.

Das folgende Video erläutert den gesamten Ablauf der Illumina-Sequenzierung.

Fazit

Die Illumina-Sequenzierung ist eine Sequenzierungsmethode der nächsten Generation. Illumina-Sequenzierung ist an der Herstellung einer Sequenzierungsbibliothek mit 200 bis 600 Basenpaaren langen DNA-Fragmenten beteiligt. Die vier Schritte der Illumina-Sequenzierung umfassen die Bibliotheksvorbereitung, die Cluster-Generierung, die Sequenzierung und die Datenanalyse. Da die Illumina-Sequenzierung Sequenzlesevorgänge mit hoher Genauigkeit liefert, ist dies die weltweit am weitesten verbreitete Sequenzierungsmethode.

Referenz:

1. "Sequenzierung durch Synthese (SBS)". Sequenzierungstechnologie | Sequenzierung durch Synthese, Hier verfügbar.

Bildhöflichkeit:

1. "DNA Processing Preparation" von DMLapato - Eigene Arbeit (CC BY-SA 4.0) über Commons Wikimedia
2. "Oligonukleotidketten in Fließzellen" von DMLapato - Eigene Arbeit (CC BY-SA 4.0) über Commons Wikimedia
3. "Sequenzierung durch Synthese reversible Terminatoren" Von Abizar Lakdawalla (talk) - Ich habe dieses Werk ganz allein (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia erstellt
4. "Cluster-Generierung" von DMLapato - Eigene Arbeit (CC BY-SA 4.0) über Commons Wikimedia