Wie funktioniert Southern Blotting?

Southern Blotting ist eine Technik, die zum Nachweis spezifischer DNA-Fragmente in einer Probe verwendet wird. Die Blotting-Technik beinhaltet die Trennung von DNA-Fragmenten basierend auf der Größe mittels Gelelektrophorese, Übertragen der grßenfraktionierten DNA-Probe auf eine Filtermembran, Hybridisieren der spezifischen DNA-Fragmente mit einer markierten, sequenzspezifischen Sonde und Nachweisen der markierten Banden.

Neben der Identifizierung spezifischer DNA in einer Probe kann die Größe und Häufigkeit eines bestimmten DNA-Typs auch durch Southern-Blotting bestimmt werden. Der Prozess des Southern Blots wird in diesem Artikel beschrieben.

Wichtige Bereiche

1. Was ist Southern Blotting?
     - Definition, Prinzip, Anwendungen
2. Wie funktioniert Southern Blotting?
     - Prozess des Southern-Blots

Schlüsselbegriffe: DNA, Gelelektrophorese, Hybridisierungssonde, Nylonmembran, Restriktionsverdauung, Southern Blotting

Was ist Southern Blotting?

Southern Blotting ist eine Hybridisierungstechnik, die zur Identifizierung spezifischer DNA in einer Probe verwendet wird. Die Technik wurde erstmals 1975 von Edward M. Southern entwickelt. Dieser Prozess identifiziert DNA-Sequenzen, Größe und Häufigkeit einer bestimmten DNA-Sequenz in einer Probe.

Eine Southern-Blotting-Membran ist in gezeigt Abbildung 1.

Abbildung 1: Southern Blotting-Membran

Anwendungen des Southern Blots

Anwendungen des Southern-Blots werden nachstehend beschrieben.

1. Um ein bestimmtes DNA-Fragment zu erkennen
2. Um ein bestimmtes DNA-Fragment zu isolieren
3. Um Mutationen und Genumlagerungen zu identifizieren
4. In RFLP-Assays (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)
5. Um genetische Krankheiten zu erkennen
6. Infektionserreger identifizieren
7. Vaterschaftstest
8. Beim DNA-Fingerprinting zur Identifizierung von Kriminellen

Wie funktioniert Southern Blotting?

Beim Southern-Blotting werden DNA-Fragmente auf der Grundlage der Größe mittels Gelelektrophorese getrennt, in eine Membran transferiert, mit einer markierten, sequenzspezifischen Sonde hybridisiert und die markierten Banden nachgewiesen. Die Schritte des Southern-Blots sind nachstehend beschrieben.

1. DNA-Verdauung - Die DNA-Probe wird durch Restriktionsenzyme verdaut, um DNA-Fragmente zu erhalten, und diese Fragmente werden durch PCR amplifiziert.
2. Gelelektrophorese - DNA-Fragmente werden durch Gelelektrophorese größenfraktioniert.
3. Denaturierung - Das Gel mit fraktionierter DNA wird in NaOH oder HCl getränkt, um doppelsträngige DNA zu denaturieren.
4. Blotting - DNA-Fragmente im Gel werden durch ein als Blotting bezeichnetes Verfahren in eine positiv geladene Nylonmembran übertragen.
5. Backen und Blockieren - Das Löschpapier mit DNA-Fragmenten wird gebacken, um DNA auf der Membran zu fixieren. Dann werden die nicht besetzten Bindungsstellen durch Behandlung mit Rinderserumalbumin (BSA) oder Casein gesättigt.
6. Hybridisierung mit markierten Sonden - DNA-gebundene Membran wird mit einer markierten Sonde behandelt, die eine komplementäre Nukleotidsequenz zu dem interessierenden DNA-Fragment enthält. Hybridisierungssonden sind im Allgemeinen 100 bis 500 bp lang und sie sind mit radioaktiven Nukleotiden markiert.
7. Visualisierung durch Autoradiogramm - Die sondengebundene Membran wird unter Autoradiogramm sichtbar gemacht, um die Muster des interessierten DNA-Fragments zu erhalten.

Abbildung 2: Southern Blotting

Der gesamte Vorgang des Southern-Blots ist in gezeigt Figur 2.

Fazit

Southern Blotting ist eine Hybridisierungstechnik, die zur Identifizierung spezifischer DNA-Sequenzen aus einer Probe verwendet wird. Dabei wird die DNA-Probe durch Restriktionsenzyme fraktioniert und die Mischung auf einem Gel laufen gelassen. Dann wird das Bandenmuster im Gel in eine Nylonmembran übertragen und mit einer markierten Sonde hybridisiert, wodurch das interessierte Fragment nachgewiesen werden kann.

Referenz:

1. "Southern Blotting" Thermo Fisher Scientific, Hier verfügbar.

Bildhöflichkeit:

1. "Southern Blot Membrane" Von Bojan Žunar - Eigene Arbeit (CC BY-SA 4.0) über Commons Wikimedia
2. „Abbildung 17 01 05" von CNX OpenStax - (CC BY 4.0) über Commons Wikimedia