So berechnen Sie die Transfektionseffizienz

Die Transfektionseffizienz kann durch Zählen der Anzahl der transfizierten Zellen über die Gesamtzellen in einer bestimmten Probe berechnet werden. Die Anzahl der Zellen kann auf zwei Arten gezählt werden. Die am häufigsten verwendete Methode ist die Verwendung von leicht nachvollziehbaren Reportern. Diese Reporter können grünes Fluoreszenzprotein (GFP), Luciferase, Beta-Galactosidase und sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) sein. Die neueste Methode zur Berechnung der Transfektionseffizienz besteht in der Markierung von Nukleinsäuren, wodurch die Verfolgung der intrazellulären Abgabe von ihnen ermöglicht wird. Einige andere Ansätze wie Western Blotting, Immunfärbung und funktionelle Assays können ebenfalls zur Berechnung der Transfektionseffizienz verwendet werden. Da die Transfektionseffizienz von mehreren experimentellen Parametern abhängt, ist die Bestimmung der Transfektionseffizienz der Schlüssel zur Bestimmung des Einflusses verschiedener Faktoren auf die Transfektion.

Wichtige Bereiche

1. Welche Methoden werden zur Berechnung der Transfektionseffizienz verwendet?
     - Reporter-Systeme
2. So berechnen Sie die Transfektionseffizienz
     - Zellzählung

Schlüsselbegriffe: Durchflusszytometrie, GFP, Nukleinsäuremarkierung, Reporter System, Transfektionseffizienz

Welche Methoden werden zur Berechnung der Transfektionseffizienz verwendet?

Zur Berechnung der Transfektionseffizienz werden verschiedene Methoden verwendet.

1. Reportersysteme

- Grünes Fluoreszenzprotein (GFP) - GFP kommt in Quallen natürlich vor. Es wird sowohl für die qualitative als auch für die quantitative Analyse transfizierter Zellen durch gleichzeitige Transfektion des GFP-Gens mit dem interessierenden Gen verwendet. Qualitative Analysen können unter einem Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden. Quantitative Analysen können durch Durchflusszytometrie durchgeführt werden. Neben GFP können auch rotes Fluoreszenzprotein (RFP) und gelbes Fluoreszenzprotein (YFP) als Reporter verwendet werden. E coli Kolonien, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, sind in gezeigt Abbildung 1.

Abbildung 1: Fluoreszenzproteine

• Luciferase - Luciferase kommt natürlicherweise in Glühwürmchen vor und erzeugt Licht. Luciferase-Assays sind sehr empfindlich und können für die quantitative Analyse von transfizierter DNA verwendet werden.
• Beta-Galactosidase - Beta-Galactosidase wird in gefunden E coli. Es wird in der qualitativen Analyse mit X-gal und der quantitativen Analyse mit kolorimetrischen, fluoreszierenden oder chemilumineszenten Methoden verwendet.
• Sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) - SEAP ist ein hitzestabiler Reporter, der bei Expression aus Säugetierzellen ausgeschieden wird.

2. Nukleinsäuremarkierung - Fluoreszenzmarkierte Plasmide können bei der Transfektion verwendet werden. Dann können sie unter einem Fluoreszenzmikroskop gezählt werden.

3. Western Blotting, Immunfärbung und andere funktionelle Assays

So berechnen Sie die Transfektionseffizienz

Die Anzahl der Zellen, die den Reporter aufweisen, und die Anzahl der Zellen, die den Reporter nicht aufweisen, können unter einem Mikroskop oder mittels Durchflusszytometrie gezählt werden. Der Prozentsatz der Zellen, die den Reporter aufweisen, gibt die Transfektionseffizienz an.

Abbildung 2: Transfektionseffizienz

Fazit

Die Transfektionseffizienz kann berechnet werden, indem die Anzahl der Zellen, die transfizierte DNA aufweisen, über die Gesamtzahl der Zellen in der Probe ermittelt wird. Die Anzahl der Zellen kann unter dem Mikroskop oder durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Reportersystems berechnet werden.

Referenz:

1. "Transfektionseffizienz messen". Mirus Bio LLC, Hier verfügbar.

Bildhöflichkeit:

1. “E. Coli, das fluoreszierende Proteine ​​exprimiert “Von Erin Rod - Eigene Arbeit, (CC BY-SA 4.0) über Commons Wikimedia