Wie man mRNA aus Gesamt-RNA isoliert

Die Oligo-dT / Carrier-Kombinationen werden hauptsächlich bei der Reinigung von mRNA aus Gesamt-RNA durch eine als Affinitätschromatographie bekannte Technik verwendet. Es gibt zwei Hauptverfahren zum Isolieren von mRNA aus Gesamt-RNA basierend auf dem Zelltyp. nämlich ein direktes Verfahren zur mRNA-Isolierung und ein Minus-Verfahren zur mRNA-Isolierung. Beide Methoden werden in diesem Artikel erläutert.

Messenger-RNA (mRNA) ist ein Transkriptionsprodukt, das aus einer Reihe von RNA-Nukleotiden besteht. Es trägt Informationen in Genen vom Zellkern bis zum Zytoplasma für die Proteinsynthese. Die RNA-Isolierung aus einer bestimmten Zelllinie führt zu Gesamt-RNA, die aus rRNAs und tRNAs zusammen mit mRNAs besteht. Daher sollte die mRNA während der Untersuchung des Transkriptoms der Zelllinie von der Mischung der Gesamt-RNA getrennt werden. Einzigartige Eigenschaften von mRNA wie das Vorhandensein eines Poly (A) -Schwanzes am 3'-Ende des mRNA-Moleküls werden für die Trennung verwendet. Da Oligo-dT-Moleküle komplementär zum Poly (A) -Schwanz sind, kann mRNA aus einem Gemisch von Gesamt-RNA isoliert werden.

Wichtige Bereiche

1. Was ist mRNA?
     - Definition, Struktur, Funktion
2. Wie ist die Zusammensetzung der Gesamt-RNA?
    - mRNA, rRNA, tRNA
3. Wie man mRNA aus Gesamt-RNA isoliert
    - Verwendung von Oligo-dT / Carrier-Molekülen

Schlüsselbegriffe: Affinitätschromatographie, Messenger-RNA (mRNA), Minus-Methode, Oligo-dT, Poly (A) -Schwanz, Gesamt-RNA

Was ist mRNA?

Die mRNA ist ein Transkript eines Protein-kodierenden Gens. Es wird in Eukaryonten im Zellkern produziert und trägt Informationen für die Produktion eines bestimmten Proteins in das Zytoplasma. Es wird während der Translation in eine Aminosäuresequenz des Proteins übersetzt, die von Ribosomen unterstützt wird. Das durch Transkription von Eukaryonten produzierte Primärtranskript wird als prä-mRNA bezeichnet.

1: mRNA-Struktur

Während posttranskriptioneller Modifikationen wird ein ausgereiftes mRNA-Molekül mit mehreren Merkmalen wie 5'-Kappe und Poly (A) -Schwanz hergestellt. Die Gesamt-mRNA eines bestimmten Organismus wird als Transkriptom bezeichnet.

Wie ist die Zusammensetzung der Gesamt-RNA?

Das Ergebnis der RNA-Isolierung wird als Gesamt-RNA bezeichnet. Es besteht aus allen drei Haupttypen von RNA, die von einer Zelle produziert werden. Sie sind mRNA, tRNA und rRNA. Sowohl tRNA als auch rRNA helfen bei der Translation. Die Größe der eukaryontischen mRNA beträgt 0,5 bis 20 kb. Transfer-RNA (tRNA) bringt während der Translation entsprechende Aminosäuren mit. Es ist 76-90 Basenpaare lang und besteht aus einer Anticodonregion, die zu einem bestimmten Codon auf der mRNA komplementär ist. Ribosomale RNA (rRNA) ist eine Komponente von Ribosomen. Einige der menschlichen rRNAs sind 5 kb lang.

Über 90% der gesamten RNA besteht aus tRNA und rRNA. Nur 1-5% der gesamten RNA sind mRNA. Eine typische Säugerzelle kann aus ungefähr 500.000 mRNA-Molekülen pro Zelle bestehen. Die Menge eines bestimmten Typs von mRNA kann 15 bis 20 000 Kopien pro Zelle sein.

Wie man mRNA aus Gesamt-RNA isoliert

Eine Reihe molekularbiologischer Techniken wie die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek, die Probenvorbereitung für die Mikroarray-Präparation, die Northern-Blot-Analyse für schwach exprimierte Gene usw. erfordern mRNA von hoher Qualität. Es gibt zwei Hauptmethoden zum Isolieren von mRNA aus Gesamt-RNA basierend auf dem Zelltyp: direkte Methode der mRNA-Isolierung und Minus-Methode der mRNA-Isolierung.

Direkte Methode der mRNA-Isolierung

Das Prinzip der Trennung reifer mRNA von eukaryotischer Gesamt-RNA beinhaltet die Affinitätsselektion / Affinitätschromatographie von polyadenylierter mRNA unter Verwendung von Oligo-dT (Oligodeoxthymidylat), das zum Poly (A) -Schwanz komplementär ist. Möglich wird dies durch das Fehlen eines Poly (A) -Schwanzes in den beiden anderen RNA-Typen: tRNA und rRNA. 

mRNA besteht aus 30-200 Adeninnukleotiden in seinem Poly (A) -Schwanz. Affinitätssäulen, die mit einer Kombination aus Oligo-dT / Träger gefüllt sind, werden bei der Isolierung von mRNA aus Gesamt-RNA verwendet. Die Oligo-dT / Träger-Kombination kann entweder Cellulose-gebundenes Oligo-dT, biotinyliertes Oligo-dT mit Streptavidin-gekoppelten Magnetkügelchen oder Oligo-DT-gekoppelte Polystyrol-Latexkügelchen sein. Alle experimentellen Bedingungen sollten unter RNase-freien Bedingungen erfolgen, um den enzymatischen Abbau von RNA zu verhindern.

Abbildung 2: Affinitätschromatographie

Die Gesamt-RNA sollte in einem Hochsalzpuffer gelöst und kurz auf 65 bis 70 ° C erhitzt werden, um die Sekundärstrukturen der RNA zu zerstören. Die Bedingungen für die Isolierung von RNA variieren zwischen kommerziell erhältlichen Kits zur mRNA-Isolierung. Die Herstellung von Poly (A) -RNA oder mRNA besteht jedoch aus drei Schritten.

1. Hybridisierung von Poly (A) -RNA an Oligo-dT-Moleküle, die an einen Träger gebunden sind
2. Abwaschen von ungebundener RNA
3. Elution von Poly (A) -RNA aus Oligo-dT / Träger-Kombination unter Bedingungen niedriger Stringenz

Minus Methode der mRNA-Isolierung

Oligo-dT-basierte Reinigung von mRNA ergibt nur mRNA mit einem Poly (A) -Schwanz oder reifer eukaryotischer mRNA. Daher kann ein anderes als Minus-Verfahren bekanntes Verfahren bei der Reinigung von mRNA verwendet werden, die keinen Poly (A) -Schwanz aufweist. Dieses Verfahren kann bei der Isolierung von mRNA aus Hefe und bakterieller Gesamt-RNA verwendet werden. Es kann auch bei der Isolierung eines unreifen mRNA-Typs zusammen mit der reifen mRNA aus eukaryotischen Zellen verwendet werden. Es beinhaltet die Anreicherung des Transkriptoms durch Abreichern großer ribosomaler RNA an Gesamt-RNA. Der RiboMinus^TM Das Transcriptome Isolation Kit von ThermoFisher Scientific verwendet drei Schritte zur effizienten Reinigung von mRNA aus Hefe und bakterieller Gesamt-RNA.

1. Hybridisierung von Gesamt-RNA mit rRNA-Sequenz-spezifischen 5'-Biotin-markierten Oligonukleotidsonden
2. Entfernung des mit rRNA / 5'-Biotin markierten Sondenkomplexes zusammen mit den Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen
3. Reinigung von Verunreinigungen und Elution von mRNA.

Fazit

Die Gesamt-RNA setzt sich aus den drei Haupttypen der RNA zusammen: mRNA, rRNA und tRNA. Die Reinigung von mRNA aus Gesamt-RNA ist für die Analyse des Transkriptoms eines bestimmten Organismus wesentlich. Die Reinigungsverfahren basieren auf dem Typ der mRNA. Eukaryontische mRNA, die einen Poly (A) -Schwanz enthält, kann durch Affinitätschromatographie mit Oligo-dT isoliert werden. Unreife eukaryotische mRNA und mRNA aus Hefe- und Bakterienzellen können durch Abreichern großer rRNA an Gesamt-RNA isoliert werden.

Referenz:

1. „mRNA-Extraktion“. Thermo Fisher Scientific, hier erhältlich.
2. "RNA-Extraktion nach RNA-Typ". Thermo Fisher Scientific, hier erhältlich.

Bildhöflichkeit:

1. "Reife mRNA" (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia
2. "Affinity" von Jamit bei English Wikibooks - Von en.wikibooks an Commons von Adrignola unter Verwendung von CommonsHelper (Public Domain) über Commons Wikimedia übertragen