Was ist der Unterschied zwischen einfach verdautem Plasmid und doppelt verdautem Plasmid?

Das Hauptunterschied zwischen einfach verdautem Plasmid und doppelt verdautem Plasmid ist das einzelne Restriktionsenzyme führen zu einem einzelnen verdauten Plasmid, wohingegen zwei verschiedene Arten von Restriktionsenzymen zu einem doppelt verdauten Plasmid führen. Weiterhin kann die Insertion des Fremd-DNA-Fragments in beiden Orientierungen mit einfach verdauten Plasmiden erfolgen, während die Insertion des Fremd-DNA-Fragments nur in der richtigen Orientierung mit doppelt verdauten Plasmiden erfolgt.

Einfach verdautes Plasmid und doppelt verdautes Plasmid sind zwei Arten von Plasmiden, die in der rekombinanten DNA-Technologie zur Herstellung rekombinanter DNA verwendet werden.

Wichtige Bereiche

1. Was ist ein einzeln verdautes Plasmid?
     - Definition, Selbstligation, Orientierung
2. Was ist ein doppelt verdautes Plasmid?
     - Definition, Doppelverdauung, Orientierung
3. Was sind die Ähnlichkeiten zwischen einfach verdautem Plasmid und doppelt verdautem Plasmid?
     - Überblick über allgemeine Funktionen
4. Was ist der Unterschied zwischen einfach verdautem Plasmid und doppelt verdautem Plasmid?
     - Vergleich der wichtigsten Unterschiede

Schlüsselbegriffe

Doppelverdautes Plasmid, Doppelverdauung, Orientierung, Rekombinantes Plasmid, Einzelverdautes Plasmid, Einzelverdauung

Was ist ein einzeln verdautes Plasmid?

Einzelverdaute Plasmide sind Plasmide, die nur mit einem einzigen Restriktionsenzym gespalten werden. Daher wird dieser Prozess als Einzelverdauung bezeichnet. Im Allgemeinen enthalten Plasmide, die in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden, nur eine einzige Restriktionsstelle für ein bestimmtes Restriktionsenzym. Daher macht ein einzelner Verdau das zirkuläre Plasmid linear und ergibt ein einzelnes DNA-Fragment. Die beiden Enden dieses DNA-Fragments sind miteinander kompatibel. Daher können sie sich während der nachfolgenden Ligation mit dem Insert selbst ligen. 

Abbildung 1: Einzelverdautes Plasmid

Hier muss das Insert auch mit dem gleichen Restriktionsenzym gespalten werden, um kompatible Enden mit dem Plasmid herzustellen. Daher erfolgt die Ligation in zwei möglichen Orientierungen: in der 5'-zu-3'-Orientierung und der 3'-zu-5'-Orientierung. Die Inserts mit derselben Orientierung wie die Promotorregion können jedoch eine Transkription durchlaufen. Daher ist diese Orientierung als richtige Orientierung bekannt. Vor dem Fortfahren müssen die rekombinanten Plasmide mit der richtigen Orientierung durch Screening der transformierten Kolonien entweder durch PCR oder durch biochemische Assays ausgewählt werden.

Was ist ein doppelt verdautes Plasmid?

Doppelverdaute Plasmide sind die Plasmide, die mit zwei Restriktionsenzymen doppelt verdaut werden. Hier kann diese Reaktion in einem einzigen Rohr durchgeführt werden. Die Restriktionsstellen für beide Verdauungen liegen innerhalb der Restriktionserkennungsstelle im Plasmid. Daher führt die Doppelverdauungsreaktion auch zu einem einzelnen DNA-Fragment. Jedes der beiden Enden wird jedoch von einem anderen Restriktionsenzym produziert. Daher sind diese Enden nicht miteinander kompatibel und unterliegen keiner Selbstligation.

Abbildung 2: Doppelverdautes Plasmid

Am wichtigsten ist, dass das Insert in der richtigen Orientierung mit doppelt verdauten Plasmiden ligiert werden kann, indem die Enden des Inserts verdaut werden, um in der richtigen Orientierung zu ligieren. Doppelverdaute Plasmide liefern daher nur die rekombinanten Plasmide mit korrekter Orientierung, was die anschließende Auswahl der Orientierung überflüssig macht. Dies spart Zeit, da es einen vollständigen Schritt vom rekombinanten DNA-Herstellungsverfahren reduziert.

Ähnlichkeiten zwischen einfach verdautem Plasmid und doppelt verdautem Plasmid

• Einzelverdautes Plasmid und doppelt verdautes Plasmid sind zwei Arten von Plasmiden, die in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden.
• Einzelverdauung und Doppelverdauung können in einer Einzelschrittreaktion durchgeführt werden.
• In beiden ist auch das Fremd-DNA-Fragment zwischen die beiden Enden der verdauten Plasmide eingefügt.
• Weiterhin ergibt sowohl der Einzel- als auch der Doppelverdau eines Plasmids ein einzelnes DNA-Fragment, während zwei DNA-Fragmente auftreten, wenn ein rekombinantes Plasmid verdaut wird.

Unterschied zwischen einfach verdautem Plasmid und doppelt verdautem Plasmid

Definition

Einfach verdautes Plasmid bezieht sich auf ein Plasmid, das durch ein einzelnes Restriktionsenzym verdaut wird, während sich doppelt verdautes Plasmid auf ein Plasmid bezieht, das durch zwei verschiedene Restriktionsenzyme verdaut wird. Diese Definitionen erklären den Hauptunterschied zwischen einfach verdautem Plasmid und doppelt verdautem Plasmid.

Endet

In einfach verdauten Plasmiden produziert der Verdau mit demselben Restriktionsenzym beide Enden, während in doppelt verdauten Plasmiden der Verdau mit einem anderen Restriktionsenzym jedes Ende produziert. Daher ist dies ein wichtiger Hauptunterschied zwischen einfach verdautem Plasmid und doppelt verdautem Plasmid.

Selbstligation

Darüber hinaus ist die Selbstligation ein Hauptunterschied zwischen einfach verdauten Plasmiden und doppelt verdauten Plasmiden. Die Enden der einfach verdauten Plasmide sind für die Selbstligation miteinander kompatibel, während die Enden der doppelt verdauten Plasmide für die Selbstligierung nicht miteinander kompatibel sind.

Bedeutung

Darüber hinaus kann die Insertion eines Fremd-DNA-Fragments in beiden Orientierungen in den einfach verdauten Plasmiden erfolgen, während die Insertion des Fremd-DNA-Fragments in der richtigen Orientierung in den doppelt verdauten Plasmiden erfolgen kann.

Arten von rekombinanten Plasmiden

Ein einzeln verdautes Plasmid kann drei Arten von Plasmiden erzeugen: zwei rekombinante Plasmide mit entgegengesetzten Orientierungen und ein selbstligiertes Plasmid ohne Insert. Inzwischen kann ein doppelt verdautes Plasmid nur einen Typ von rekombinantem Plasmid produzieren, der sich in der richtigen Orientierung befindet. Somit ist dies ein weiterer Hauptunterschied zwischen einfach verdautem Plasmid und doppelt verdautem Plasmid. 

Zeitersparnis

Die rekombinanten Fragmente von einfach verdauten Plasmiden müssen nach ihrer richtigen Orientierung ausgewählt werden, während die doppelt verdauten Plasmide die korrekte Orientierung des Fremd-DNA-Fragments gewährleisten. Doppelverdaute Plasmide sparen daher Zeit bei den rekombinanten DNA-Techniken und nicht einfach verdaute Plasmide.

Fazit

Einzelverdaute Plasmide werden mit einem einzigen Restriktionsenzym verdaut, was zu kompatiblen Enden mit der Selbstligation führt. Darüber hinaus kann ihre Ligation mit dem Fremd-DNA-Fragment in beiden Orientierungen erfolgen. Daher müssen rekombinante Plasmide mit der richtigen Orientierung ausgewählt werden. Andererseits werden doppelt verdaute Plasmide mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten. Daher sind die beiden Enden nicht für die Selbstligatur geeignet. Zusätzlich kann das fremde DNA-Fragment mit doppelt verdauten Plasmiden in der richtigen Orientierung ligiert werden. Daher besteht der Hauptunterschied zwischen einfach verdautem Plasmid und doppelt verdautem Plasmid in der Art des Verdaus und der Orientierung des Inserts.

Referenz:

1. Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT et al. Eine Einführung in die Genanalyse. 7. Ausgabe. New York: W. H. Freeman; 2000. Herstellung rekombinanter DNA. Hier verfügbar