Warum wird PCR im Prozess der DNA-Sequenzierung verwendet?

DNA-Sequenzierung ist eine Technik, die zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines bestimmten DNA-Fragments verwendet wird. Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung sind zwei Arten von Sequenzierungsmethoden. Fluoreszenzmarker werden verwendet, um jedes Nukleotid in der Sequenz zu identifizieren. PCR wird zum Einbau der Fluoreszenzmarker in das DNA-Fragment verwendet. PCR (Polymerasekettenreaktion) ist eine Technik, die im Labor zur Herstellung von Millionen von Kopien eines bestimmten DNA-Fragments verwendet wird. Die Analyse der PCR-Fragmente im Gel ermöglicht die Bestimmung der Nukleotidsequenz des DNA-Fragments.

Wichtige Bereiche

1. Was ist Sequenzierung?
     - Definition, Arten der Sequenzierung - Sequenzierung der nächsten Generation, Sanger-Sequenzierung
2. Warum wird PCR im Prozess der DNA-Sequenzierung verwendet?
    - Einbau von Fluoreszenzfarbstoffen während der PCR

Schlüsselbegriffe: ddNTPs, dNTPs, DNA-Sequenzierung, Fluoreszenzfarbstoffe, Next-Generation-Sequenzierung, PCR, Sanger-Sequenzierung

Was ist Sequenzierung?

Die Sequenzierung ist eine Labortechnik, mit der die Nukleotidsequenz eines DNA-Moleküls bestimmt wird. Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung sind die zwei Hauptmethoden der DNA-Sequenzierung. Beide DNA-Sequenzierungsverfahren sind am Einbau von fluoreszierenden Herstellern in den DNA-Strang durch PCR zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines bestimmten DNA-Strangs beteiligt.

Sanger-Sequenzierung

Die erste Sequenzierungsmethode, die als Sanger-Sequenzierung bekannt ist, wurde zuerst von Fredric Sanger im Jahr 1975 entwickelt. Daher ist sie als Sanger-Sequenzierung bekannt. Die Sanger-Sequenzierung ist am selektiven Einbau von kettenabbrechenden Didesoxynukleotiden (ddNTPS) durch DNA-Polymerase während des in vitro DNA-Synthese. Daher wird es auch als Kettenabbruchverfahren bezeichnet. Reguläre Desoxynukleotide (dNTPs) werden zur Verlängerung des DNA-Strangs verwendet. Dem Reaktionsgemisch werden zur Beendigung des Kettenwachstums auch ddNTPs zugesetzt. Die vier Arten von ddNTPs werden vier separaten PCR-Gemischen hinzugefügt. Daher werden vier separate PCR-Reaktionen durch Hinzufügen von ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP durchgeführt. Für jedes Reaktionsgemisch, ein einzelner Typ von zugesetztem ddNTP (wenn ddATP hinzugefügt wird), wird das Wachstum verschiedener Amplicons an jedem (A) -Nucleotid im DNA-Fragment beendet. Dann werden die vier Reaktionen durch Gelelektrophorese getrennt. Die emittierende Fluoreszenz wird mit einem Fluorometer nachgewiesen. Die Sanger-Sequenzierung wird häufig zur Bestimmung der Sequenz der bei der DNA-Klonierung verwendeten Fragmente und der durch PCR amplifizierten Fragmente verwendet. Der allgemeine Ablauf der Sanger-Sequenzierung ist in gezeigt Abbildung 1.

Abbildung 1: Allgemeiner Ablauf der Sanger-Sequenzierung

Next-Generation Sequencing

Next-Generation Sequencing ist der Sammelname für die neuesten DNA-Sequenzierungstechnologien. Bei der Sequenzierung der nächsten Generation werden mehrere Sequenzierungsreaktionen gleichzeitig im Mikromaßstab auf einem Chip durchgeführt. Beide Sequenzierungsmethoden verwenden markierte Nukleotide mit Fluoreszenz, die während der PCR in das Amplikon eingebaut werden, wodurch die Bestimmung der Nukleotidsequenz ermöglicht wird. Die Kettenabbruchaddition von Fluoreszenzmarkern ist auch an der Sequenzierung der nächsten Generation beteiligt. Der Hauptunterschied zwischen der Sanger-Sequenzierung und der Sequenzierung der nächsten Generation ist jedoch die Verwendung der Kapillarelektrophorese zur Trennung von unterschiedlich markierten Amplicons bei der Sequenzierung der nächsten Generation. Die Kapillarelektrophorese ist eine analytische Trennmethode, bei der die Moleküle aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilität getrennt werden.

Warum wird PCR im Prozess der DNA-Sequenzierung verwendet?

Während der Sequenzierung sollten fluoreszierende Marker zur Bestimmung der Nukleotidsequenz in den DNA-Strang eingebaut werden. Diese Einarbeitung erfolgt während der PCR. Im Allgemeinen werden die vier Arten von dNTPs während der PCR in den neu synthetisierenden DNA-Strang eingebaut. Dieses Phänomen wird bei der DNA-Sequenzierung verwendet, um fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide (ddNTPs) in das Amplifikat einzubauen, während die DNA-Sequenz bestimmt wird.

Im Allgemeinen wird der PCR-Reaktionsmischung während der DNA-Sequenzierung ein Gemisch aus regulären vier Basen (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) zugesetzt.

Zusätzlich wird eines der vier Didesoxynukleotide (ddNTPs; ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP) in einer geringen Konzentration als Komponenten der PCR-Reaktion zugegeben. Schließlich müssen vier PCR-Reaktionen durchgeführt werden, um die vollständige Sequenz zu bestimmen. 

1: Eine bestimmte DNA-Sequenz

Das DdNTPs haben keine 3'-OH-Gruppe zu dem das ankommende Nukleotid durch DNA-Polymerase hinzugefügt wird. Daher beendet der Einbau des ddNTP das Kettenwachstum. Somit tritt in jeder der vier PCR-Reaktionen der Kettenabbruch an einer bestimmten Base auf. Diese ddNTPs werden auch mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen eingebaut (Das ddATP ist mit grünem Farbstoff markiert. das ddGTP ist mit gelbem Farbstoff markiert; das ddCTP ist blau gekennzeichnet, und das ddTTP ist mit rotem Farbstoff markiert). Der Einbau der Fluoreszenzfarbstoffe und der Kettenabbruch erfolgen während der PCR. Die Amplikons werden auf einem Gel laufen gelassen und das Gel wird mit einem Fluorometer im automatisierten Sequenzer zur Bestimmung der Nukleotidsequenz auf Fluoreszenz abgetastet.

Fazit

DNA-Sequenzierung ist eine Labortechnik, die zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines bestimmten DNA-Fragments verwendet wird. Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung integrieren verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe in das DNA-Fragment, um die Nukleotidsequenz während einer PCR zu bestimmen.

Referenz:

1. Adams, Jill U. "DNA Sequencing Technologies". Nature News, Nature Publishing Group, erhältlich hier.
2. „DNA-Sequenzierung - Automatisierte Sequenzierung mit Fluoreszenzfarbstoffen.“ JRank-Artikel, hier erhältlich.

Bildhöflichkeit:

1. "Sanger-Sequenzierung - Allgemein" Benutzer: Fibonachi - Benutzer (CC BY-SA 1.0) über Commons Wikimedia [geändert] 2. "DNA-Sequenz" Von Sjef - Eigene Arbeit (Public Domain) über Commons Wikimedia