Unterschied zwischen NGS- und Sanger-Sequenzierung

Schlüsseldifferenz - NGS vs. Sanger-Sequenzierung
 

Next Generation Sequencing (NGS) und Sanger-Sequenzierung sind zwei Arten von Nukleotid-Sequenzierungstechniken, die im Laufe der Zeit entwickelt wurden. Die Sanger-Sequenzierungsmethode war seit vielen Jahren weit verbreitet und wurde aufgrund ihrer Vorteile kürzlich von NGS ersetzt. Der Hauptunterschied zwischen NGS und Sanger Sequencing ist der NGS arbeitet nach dem Prinzip der Sequenzierung von Millionen von Sequenzen gleichzeitig auf schnelle Weise durch ein Sequenziersystem, während die Sanger-Sequenzierung aufgrund des selektiven Einbaus von Didesoxynukleotiden durch das DNA-Polymerase-Enzym während der DNA-Replikation und der resultierenden Fragmentseparation durch Kapillare auf dem Prinzip der Kettenabbruchfunktion beruht Elektrophorese.

INHALT
1. Übersicht und Schlüsseldifferenz
2. Was ist Nukleotidsequenzierung?
3. Was ist NGS?
4. Was ist Sanger-Sequenzierung?
5. Side-by-Side-Vergleich - NGS vs Sanger Sequencing
6. Zusammenfassung

Was ist Nukleotidsequenzierung??

Genetische Informationen werden in den Nukleotidsequenzen der DNA oder RNA eines Organismus gespeichert. Der Vorgang des Bestimmens der korrekten Reihenfolge von Nukleotiden (unter Verwendung von vier Basen) in einem gegebenen Fragment (in einem Gen, einem Cluster von Genen, einem Chromosom und einem vollständigen Genom) ist als Nukleotidsequenzierung bekannt. In genomischen Studien, forensischen Studien, Virologie, biologischen Systematik, medizinischer Diagnostik, Biotechnologie und in vielen anderen Bereichen ist es sehr wichtig, die Struktur und Funktion von Genen zu analysieren. Es gibt verschiedene Arten von Sequenzierungsmethoden, die von Wissenschaftlern entwickelt wurden. Unter ihnen, Sanger-Sequenzierung wurde 1977 von Frederick Sanger entwickelt und wurde lange Zeit verwendet und populär gemacht Next Generation Sequencing ersetzte es.

Was ist NGS??

Next Generation Sequencing (NGS) ist ein Begriff, der sich auf moderne Sequenzierungsprozesse mit hohem Durchsatz bezieht. Es beschreibt eine Reihe verschiedener moderner Sequenzierungstechnologien, die die genomischen Studien und die Molekularbiologie revolutionierten. Diese Techniken sind Illumina-Sequenzierung, Roche-454-Sequenzierung, Ionenproton-Sequenzierung und SOLiD-Sequenzierung (Sequenzierung durch Oligo-Ligationsdetektion). NGS-Systeme sind schneller und billiger. In NGS-Systemen werden vier Haupt-DNA-Sequenzierungsverfahren verwendet, nämlich; Pyrosequenzierung, Sequenzierung durch Synthese, Sequenzierung durch Ligation und Ionenhalbleitersequenzierung. Eine große Anzahl von DNA- oder RNA-Strängen (Millionen) kann parallel sequenziert werden. Es erlaubt die Sequenzierung des gesamten Genoms von Organismen innerhalb kurzer Zeit, im Gegensatz zu der Sequenzierung von Sanger, die mehr Zeit benötigt.

NGS hat gegenüber der herkömmlichen Sanger-Sequenzierungsmethode viele Vorteile. Dies ist ein präziser und kostengünstiger Prozess mit hoher Geschwindigkeit, der mit einer kleinen Probengröße durchgeführt werden kann. NGS kann in metagenomischen Studien, beim Nachweis von Variationen innerhalb eines einzelnen Genoms aufgrund von Insertionen und Deletionen usw. und bei der Analyse von Genexpressionen verwendet werden.

Abbildung_1: Entwicklungen bei der NGS-Sequenzierung

Was ist Sanger-Sequenzierung??

Sanger-Sequenzierung ist eine Sequenziermethode, die 1977 von Frederick Sanger und seinen Kollegen entwickelt wurde, um die genaue Nukleotidordnung eines bestimmten DNA-Fragments zu bestimmen. Es ist auch bekannt als Kettenabbruchsequenzierung oder Didesoxy-Sequenzierung. Das Arbeitsprinzip dieses Verfahrens ist der Abbruch der Strangsynthese durch selektiven Einbau von kettenabbrechenden Didesoxynukleotiden (ddNTPs) wie ddGTP, ddCTP, ddATP und ddTTP durch DNA-Polymerase während der Replikation von DNA. Normale Nukleotide haben 3'-OH-Gruppen zur Bildung einer Phosphodiester-Bindung zwischen benachbarten Nukleotiden, um die Strangbildung fortzusetzen. DdNTPs fehlen jedoch diese 3'-OH-Gruppe und können keine Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleotiden bilden. Daher ist die Kettenverlängerung beendet.

Bei diesem Verfahren dient die zu sequenzierende einzelsträngige DNA als Templatstrang für in vitro DNA-Synthese. Andere Anforderungen sind Oligonukleotidprimer, Desoxynukleotidvorläufer und DNA-Polymeraseenzym. Wenn die flankierenden Enden des Zielfragments bekannt sind, können Primer leicht für die DNA-Replikation entworfen werden. Vier separate DNA-Synthesereaktionen werden in vier separaten Röhrchen durchgeführt. Jedes Röhrchen verfügt neben anderen Anforderungen über separate ddNTPs. Aus dem jeweiligen Nukleotid wird eine Mischung aus dNTPs und ddNTPs hinzugefügt. Ebenso werden vier separate Reaktionen in vier Röhrchen mit vier Gemischen durchgeführt. Nach den Reaktionen werden der Nachweis von DNA-Fragmenten und die Umwandlung des Fragmentmusters in Sequenzinformationen durchgeführt. Die resultierenden DNA-Fragmente werden hitzedenaturiert und durch Gelelektrophorese getrennt. Wenn radioaktive Nukleotide verwendet werden, kann das Bandenmuster im Polyacrylamidgel durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden. Wenn bei diesem Verfahren die fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotide verwendet werden, kann die Gel-Ablesung herabgesetzt und durch einen Laserstrahl geleitet werden, um vom Fluoreszenzdetektor detektiert zu werden. Um Fehler zu vermeiden, die auftreten könnten, wenn eine Sequenz vom Auge gelesen und manuell in einen Computer eingegeben wird, entwickelte sich diese Methode zur Verwendung eines automatisierten Sequenzers, der mit dem Computer gekoppelt ist.

Dies ist die Methode, mit der DNA aus dem Human Genome-Projekt sequenziert wird. Diese Methode wird immer noch mit fortgeschrittenen Modifikationen verwendet, da sie trotz eines kostspieligen und langsamen Prozesses genaue Sequenzinformationen liefert.

Abbildung 2: Sanger-Sequenzierung

Was ist der Unterschied zwischen NGS und Sanger Sequencing??

NGS vs Sanger-Sequenzierung
Next Generation Sequencing (NGS) bezieht sich auf moderne Sequenzierungsprozesse mit hohem Durchsatz. Es beschreibt eine Reihe verschiedener moderner Sequenzierungstechnologien	Sanger-Sequenzierung ist eine von Frederick Sanger entwickelte Sequenzierungsmethode zur Bestimmung der genauen Nukleotidordnung eines bestimmten DNA-Fragments.
Kosteneffektivität
NGS ist ein billigeres Verfahren, da es Zeit, Arbeitskräfte und Chemikalien reduziert.	Dies ist ein kostspieliger Prozess, da dies Zeit, Arbeitskraft und mehr Chemikalien erfordert.
Geschwindigkeit
Dies ist schneller, da sowohl die chemische Erkennung als auch die Signalerkennung vieler Stränge parallel ablaufen.	Dies ist zeitaufwändig, da die chemische Erkennung und Signalerkennung als zwei separate Prozesse erfolgt und nur auf Strang gleichzeitig gelesen werden kann.
Zuverlässigkeit
NGS ist zuverlässig.	Die Sequenzierung nach Sanger ist weniger zuverlässig
Probengröße
NGS erfordert weniger DNA.	Diese Methode benötigt eine große Menge an Template-DNA.
DNA-Basen pro sequenziertem Fragment
Die Anzahl der DNA-Basen pro sequenziertem Fragment ist niedriger als die Sanger-Methode	Generierungssequenzen sind länger als NGS-Sequenzen.

Zusammenfassung - NGS vs Sanger Sequencing

NGS und Sanger-Sequenzierung sind Nukleotid-Sequenzierungstechniken, die in der Molekularbiologie intensiv eingesetzt werden. Die Sanger-Sequenzierung ist eine frühe Sequenzierungsmethode, die durch NGS ersetzt wurde. Der Hauptunterschied zwischen NGS und Sanger-Sequenzierung ist, dass NGS ein schneller, genauer und kostengünstiger Prozess ist als die Sanger-Sequenzierung. Beide Techniken verursachten große Ausbrüche in der Genetik und Biotechnologie.

Referenz:
1. Nowrousian, Minou "Next Generation Sequencing Techniques für eukaryotische Mikroorganismen: Lösungen zur Sequenzierung biologischer Probleme." Eukaryotic Cell. Amerikanische Gesellschaft für Mikrobiologie, Sept. 2010. Web. 18. Februar 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen und A. R. Coulson. "DNA-Sequenzierung mit kettenabbrechenden Inhibitoren". Verfahren der National Academy of Sciences 74.12 (1977): 5463-467. Netz.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu und Maggie Law. „Vergleich von Sequenziersystemen der nächsten Generation.“ Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. Netz.

Bildhöflichkeit:
"Sanger-Sequenzierung" Von Estevezj - Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia 
"Entwicklungen in der nächsten Generation der Sequenzierung" Von Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) über Commons Wikimedia