Unterschied zwischen Maxam Gilbert und Sanger-Sequenzierung

Hauptunterschied - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
 

Nukleotide sind die grundlegenden Struktureinheiten und Bausteine ​​von DNA. Das DNA-Molekül besteht aus einer Polynukleotidkette. Es gibt vier verschiedene Nukleotide in der DNA. Diese Nukleotide bestehen aus vier verschiedenen stickstoffhaltigen Basen, die als A (Adenin), G (Guanin), C (Cytosin), T (Thymin) bezeichnet werden. Die Reihenfolge der Nukleotide im DNA-Molekül ist von großer Bedeutung, da sie eine wichtige genetische Information für das Wachstum und die Entwicklung von Organismen kodiert. DNA-Sequenzierung bezieht sich auf den Prozess, der die genaue Nukleotidsequenz der DNA bestimmt. Es gibt verschiedene DNA-Sequenzierungsmethoden. Die Maxam-Gilbert-Sequenzierung und die Sanger-DNA-Sequenzierung sind zwei Methoden der DNA-Sequenzierung, die zur Sequenzierung der ersten Generation gehören. Das Maxam-Gilbert-Sequenzierungsverfahren bestimmt die Basensequenz durch chemisches Spalten der markierten DNA-Fragmente am 5'-Ende vorzugsweise bei jedem der vier Nukleotide und der Gelelektrophorese. Das Sanger-Sequenzierungsverfahren bestimmt die Nukleotidsequenz durch Synthese von einsträngiger DNA unter Verwendung von DNA-Polymerase und Didesoxynukleotiden und Gelelektrophorese. Dies ist der Hauptunterschied zwischen Maxam Gilbert und Sanger Sequencing.

INHALT
1. Übersicht und Schlüsseldifferenz
2. Was ist Maxam Gilbert?
3. Was ist Sanger-Sequenzierung?
4. Side-by-Side-Vergleich - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
5. Zusammenfassung

Was ist die Maxam Gilbert-Sequenzierung??

Maxam Gilbert-Sequenzierung, auch bekannt als chemische Sequenzierungsmethode, ist eine Technik, die entwickelt wurde, um die Reihenfolge der Nukleotide in der DNA zu bestimmen. Diese Methode wurde 1976 von Walter Gilbert und Alan Maxam eingeführt und wurde populär, da sie direkt mit gereinigter DNA durchgeführt werden kann. Die Maxam-Gilbert-Methode gehört zur ersten Generation der DNA-Sequenzierung und war die erste von Wissenschaftlern weit verbreitete Sequenzierungsmethode.

Das Grundprinzip dieser Methode liegt in der Beschränkung der endmarkierten DNA - Fragmente an bestimmten Basen durch basenspezifische Chemikalien und Bedingungen sowie der Trennung der markierten Fragmente durch Elektrophorese (siehe Abbildung 01) Gel. Da die Fragmente markiert sind, kann die Sequenz des DNA-Moleküls leicht abgeleitet werden.

Die Maxam Gilbert-Methode verwendet basisspezifische Chemikalien, um die DNA an bestimmten Basen zu brechen. Zwei gebräuchliche Chemikalien, Dimethylsulfat- und Hydrazinchemikalien, werden verwendet, um Purine bzw. Pyrimidine selektiv anzugreifen.

Das Maxam-Gilbert-Sequenzierungsverfahren wird wie folgt in mehreren Schritten durchgeführt.

1. Reinigung der DNA-Sequenz unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen
2. Markierung der Enden der DNA-Fragmente durch Zugabe radioaktiver Phosphate
3. Reinigung der markierten Fragmente aus nicht markierten Fragmenten durch Gelelektrophorese
4. Trennung der endmarkierten DNA in vier Röhrchen und getrennte Behandlung mit basenspezifischen Chemikalien
5. Elektrophorese des Inhalts jedes Röhrchens in getrennten Linien auf einem Gel und Fragmenttrennung nach ihrer Länge.
6. Nachweis der Fragmente durch Autoradiographie.

Abbildung 01: Maxam-Gilbert-Sequenzierung

Was ist Sanger-Sequenzierung??

Sanger-Sequenzierung ist eine Sequenziermethode, die 1977 von Frederick Sanger und seinen Kollegen entwickelt wurde, um die Basensequenz eines bestimmten DNA-Fragments zu bestimmen. Es ist auch bekannt als Kettenabbruchsequenzierung oder Didesoxy-Sequenzierungsverfahren. Dieses Verfahren basiert auf dem Prinzip des selektiven Einbaus von kettenabbrechenden Didesoxynukleotiden (ddNTPs) wie ddGTP, ddCTP, ddATP und ddTTP durch DNA-Polymerase während der Synthese von einzelsträngiger DNA, um die Strangbildung zu beenden. Didesoxynukleotiden fehlen 3'-OH-Gruppen zur Bildung von Phosphodiester-Bindungen mit benachbarten Nukleotiden. Daher stoppt die Strangbildung, sobald ein ddNTP während der Sanger-Sequenzierung in den sich neu bildenden Strang eingebaut wird.

Bei diesem Verfahren werden vier separate DNA-Synthesereaktionen (PCR) in vier separaten Röhrchen mit einem Typ ddNTP durchgeführt. Andere Anforderungen werden auch für die Röhrchen für die PCR bereitgestellt, einschließlich Primer, dNTPs, Taq-Polymerase, spezifische Bedingungen usw. In vier Röhrchen mit vier Mischungen werden vier separate Reaktionen durchgeführt. Nach PCR-Reaktionen werden die entstehenden DNA-Fragmente heiß denaturiert und durch Gelelektrophorese getrennt. Dann werden die Fragmente unter Verwendung eines markierten (radioaktiven oder fluoreszierenden) Primers oder von dNTPs sichtbar gemacht, wie in Abbildung 02 gezeigt.

Abbildung 02: Sanger-Sequenzierung

Was ist der Unterschied zwischen Maxam Gilbert und Sanger Sequencing??

Maxam Gilbert vs Sanger-Sequenzierung
Die Maxam Gilbert-Sequenzierung ist die erste für die DNA-Sequenzierung entwickelte Technik.	Die Sanger-Sequenzierungsmethode wurde nach der Maxam-Gilbert-Sequenzierungsmethode eingeführt.
Verwendungszweck
Diese Methode wird selten verwendet.	Sanger-Sequenzierung wird routinemäßig für die Sequenzierung verwendet.
Verwendung von gefährlichen Chemikalien
Es verwendet gefährliche Chemikalien.	Die Verwendung gefährlicher Chemikalien ist im Vergleich zur Maxam-Gilbert-Methode begrenzt.
Kennzeichnung für die Erkennung
Diese Methode verwendet radioaktives P32 zur Markierung der Enden der DNA-Fragmente.	Die Sanger-Sequenzierung verwendet radioaktiv oder fluoreszenzmarkierte ddNTPs.

Zusammenfassung - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing

Die Maxam Gilbert- und Sanger-Sequenzierung sind zwei Arten von DNA-Sequenzierungstechniken, die unter die DNA-Sequenzierung der ersten Generation fallen. Die Maxam-Gilbert-Sequenzierung ist die erste Methode, die 1976 zur DNA-Sequenzierung eingeführt wurde. Sie wird durchgeführt, indem die endmarkierten DNA-Fragmente durch basenspezifische Chemikalien gebrochen werden. Daher ist es als chemische Sequenzierung bekannt. Das Sanger-Sequenzierungsverfahren wurde 1977 eingeführt und basiert auf den von ddNTP gesteuerten Kettenabbruchreaktionen. Die Sanger-Sequenzierungsmethode ist als Maxam-Gilbert-Methode aufgrund verschiedener Nachteile der Maxam-Gilbert-Methode beliebt, z. B. übermäßiger Zeitaufwand, Verwendung gefährlicher Chemikalien usw. Dies ist der Unterschied zwischen der Maxam-Gilbert- und der Sanger-Sequenzierung.

Verweise:
1. Maxam, A. M und Walter Gilbert. "Eine neue Methode zur Sequenzierung von DNA". Verfahren der National Academy of Sciences. National Acad Sciences, 9. Dezember 1976. Web. 30. März 2017
2.Heather, James M. und Benjamin Chain. "Die Sequenz von Sequenzern: Die Geschichte der Sequenzierung von DNA." Genomics. Academic Press, Januar 2016. Web. 30. März 2017
3.Pareek, Chandra Shekhar, Rafal Smoczynski und Andrzej Tretyn. "Sequenzierungstechnologien und Genomsequenzierung". Journal of Applied Genetics. Springer-Verlag, Nov. 2011. Web. 30. März 2017

Bildhöflichkeit:
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2. "Sanger-Sequenzierung" Von Estevezj - Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia