Primer für QPCR entwerfen

Quantitative oder Echtzeit-PCR wird als Routine-Assay zur Überwachung der relativen Änderungen der Genexpression unter verschiedenen experimentellen Bedingungen verwendet. Das Design von Primern sowie von Sonden während der QPCR ist einer der wichtigsten Faktoren, die die Qualität und den Erfolg des Assays beeinflussen. Für das Design von Primern für QPCR gelten mehrere Richtlinien: Der GC-Gehalt der Primer sollte 35-65% betragen; Die Schmelztemperatur der Primer sollte zwischen 60 und 68 ° C liegen. Man sollte auch Sekundärstrukturen, die Wiederholung von Gs oder Cs, die länger als 3 Basen sind, und die Bildung von Primer-Dimeren vermeiden.

Wichtige Bereiche

1. Was ist QPCR?
      - Definition, Prozess, Verwendung
2. Primer für QPCR entwerfen
     - Richtlinien für das Primer Design für QPCR

Schlüsselbegriffe: Fluoreszenzfarbstoffe, GC-Gehalt, Schmelztemperatur, Primer, Quantitative PCR (QPCR)

Was ist QPCR?

QPCR ist eine Art von PCR, mit der das Produkt in Echtzeit quantifiziert werden kann. Fluoreszenzfarbstoffe können bei der Quantifizierung von PCR-Produkten verwendet werden, indem sie in jedem Schritt markiert werden. In QPCR-Assays können zwei Methoden der Fluoreszenzmarkierung verwendet werden. Sie verwenden Fluoreszenzfarbstoffe und fluoreszenzmarkierte Sonden. Fluoreszenzfarbstoffe binden an das PCR-Produkt, während sich die Sonden mit dem PCR-Produkt anlagern, um eine stabile Triplex-DNA zu bilden. Der häufig verwendete Fluoreszenzfarbstoff in QPCCR ist SYBR Green, während die Sonden Taqman sein können. Die Verwendung von Sonden beim Nachweis von PCR-Produkten während der QPCR liefert genauere Ergebnisse und erhöht die Sensitivität des Assays.

Abbildung 1: Mechanismus der QPCR

Primer für QPCR entwerfen

Das Design von Primern für QPCR ist entscheidend für die Erhöhung der Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Sensitivität des Assays. Richtlinien für das Design von QPCR-Primern sind unten beschrieben.

1. PCR-Produkt / Amplikongröße - Die Größe des PCR-Produkts sollte 50 bis 210 Basenpaare groß sein.
2. Primerlänge - Die Länge der Primer sollte 19-23 Nukleotide betragen.
3. GC-Gehalt - Der GC-Gehalt der Primer sollte 35-65% betragen..
4. Schmelztemperatur (Tm) - Die Schmelztemperatur der Primer sollte 60-68 ° C betragen. Die Annealingtemperatur für den Assay ist 5 ° C niedriger als die Tm der Primer.
5. Exon-Exon-Übergang - Bei der Amplifikation von cDNA durch QPCR sollten die Primer den Exon-Exon-Übergang umfassen, um die Amplifikation kontaminierender DNA zu vermeiden.
6. Wiederholungen und Durchgänge - Dinukleotid-Wiederholungen (TCTCTCTCTC) und wiederholte Nukleotide (z. B. TAAAAAAAGC) sollten vermieden werden.
7. 3 'Komplementarität - Die komplementären Bereiche der 3'-Enden der Vorwärts- und Rückwärtsprimer sollten vermieden werden, um die Bildung von Primer-Dimeren zu verhindern.
8. 3'-Stabilität - G- oder C-Reste sollten am 3'-Ende des Primers enthalten sein, um die Stabilität des Anlagerns zu erhöhen.
9. GC-Klemme - Eine oder zwei GC-Klemmen am 5'-Ende des Primers erhöhen die Spezifität des Anlassens.
10. Spezifität - Die Spezifität der Primer sollte von BLAST überprüft werden
11. SNPs - Primer sollten keine bekannten SNP-Variationen (Single Nukleotide Polymorphism) enthalten

Für das Primer-Design in QPCR können verschiedene Online-Tools verwendet werden, z. B. Primer3, Primer-BLAST, IDT PrimerQuest, Primer Bank und OAT.

Abbildung 2: Bildung von Primer-Dimeren

Primer sollten so gestaltet werden, dass die Bildung von Primer-Dimeren im QPCR vermieden wird. Es ist kritisch, wenn Fluoreszenzfarbstoffe zum Nachweis des PCR-Produkts verwendet werden, da diese Farbstoffe auch an die Primer-Dimere binden, um falsch positive Ergebnisse zu erhalten.

Fazit

QPCR wird zum Nachweis und zur Quantifizierung von PCR-Produkten verwendet. Das Design von Primern ist für QPCR entscheidend, um die Genauigkeit der Ergebnisse zu erhöhen. Daher ist es wichtig, die Richtlinien zur Gestaltung von Primern für QPCR sorgfältig zu befolgen.

Referenz:

1. „Design und Optimierung von QPCR-Assays“. LSR | Bio-Rad, hier erhältlich.

Bildhöflichkeit:

 

1. “Taqman” Nach Benutzer: Braindamaged - Eigene Arbeit des ursprünglichen Uploaders (Public Domain) über Commons Wikimedia
2. "Primer Dimers formation En" von Tzachi Bar - Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia