Wie man Primer für die ortsspezifische Mutagenese entwickelt

Ortsgerichtete Mutagenese (SDM) ist eine in vitro Methode zum Erzeugen einer Mutation in einer bekannten Sequenz. Es wird oft mit PCR-basierten Methoden durchgeführt. Typischerweise werden eine oder zwei Basen bei der ortsgerichteten Mutagenese verändert. Primer können mit den gewünschten Mutationen konstruiert werden, um kleine Änderungen in der Nukleotidsequenz einzuführen. Primer-Extension und inverse PCR können verwendet werden, um große Mutationen einzuführen. Dieser Ansatz kann die Aminosäurezusammensetzung eines bestimmten Proteins verändern. Ortsgerichtete Mutagenese wird verwendet, um die Änderungen der Aktivität von Proteinen zu untersuchen. Es wird auch zur Herstellung von Fusionsproteinen verwendet.

Wichtige Bereiche

1. Was ist Site-Directed Mutagenesis (SDM)
      - Definition, Rolle, Methode
2. Wie man Primer für die ortsgerichtete Mutagenese entwickelt
     - Ersetzungen, Löschungen, Einfügungen

Schlüsselbegriffe: Deletionen, Insertionen, Mutationen, Site-Directed-Mutagenese, Substitutionen, traditionelle PCR

Was ist ortsgerichtete Mutagenese?

Ortsgerichtete Mutagenese ist eine molekularbiologische Technik, mit der spezifische Änderungen an einer Nukleotidsequenz eines Gens vorgenommen werden. Es wird verwendet, um die Aminosäuresequenz eines Proteins zu ändern, Restriktionsstellen einzuführen oder zu entfernen, Transkriptionsbindungsstellen zu zerstören und Fusionsproteine ​​zu erzeugen.

Verarbeiten

Während der ortsgerichteten Mutagenese werden die Mutationen unter Verwendung von Primern, bestehend aus der gewünschten Mutation, in die Plasmide eingeführt. Die gesamte Matrize wird durch PCR amplifiziert, wobei die Mutation in die Matrize eingebaut wird. Dann wird das Stammtemplat unter Verwendung eines Enzyms, der methylierungsabhängigen Endonuklease, aus der Probe entfernt. Das PCR-Produkt oder das gekerbte Plasmidmolekül mit der gewünschten Mutation wird in Bakterien umgewandelt. Die Plasmide können mit gewünschten Modifikationen aus den Bakterien isoliert werden. Der Prozess der ortsgerichteten Mutagenese ist in gezeigt Abbildung 1.

Abbildung 1: Ortsgerichtete Mutagenese

Es werden drei Hauptarten von Methoden verwendet, um gewünschte Mutationen in die ortsgerichtete Mutagenese einzuführen. Sie sind herkömmliche PCR, Primer-Erweiterung und inverse PCR. Primer-Extension und inverse PCR können verwendet werden, um Nukleotidänderungen im großen Maßstab einzuführen.

Traditionelle PCR

Traditionelle PCR kann verwendet werden, um eine oder zwei Nukleotidänderungen in die Zielsequenz mit modifizierten Primern einzuführen. Die Änderungen können Nukleotidsubstitutionen, -deletionen oder -additionen sein. Die Mutation wird während der PCR in das Amplikon eingebaut. Daher wird die ursprüngliche Sequenz durch die mutierte Sequenz im Primer ersetzt.

Primer Erweiterung

Bei der Primer-Extension wird die gewünschte Mutation während einer verschachtelten PCR eingebaut. Hier wird die Zielsequenz von zwei Primern flankiert. Die gewünschte Mutation wird in den internen Primer eingebaut und die Mutation wird in der zweiten PCR-Runde eingeführt. Im Allgemeinen nimmt die Spezifität einer PCR-Reaktion mit zunehmender Anzahl fehlgepaarter Nukleotide in den Primern ab. Lange interne Primer mit großen Mutationen können jedoch bei der Primer-Extension verwendet werden, da eine verschachtelte PCR die Spezifität der PCR-Reaktion erhöhen kann.

Inverse PCR

Inverse PCR ist ein Verfahren zum Amplifizieren unbekannter DNA-Fragmente durch Design von Primern für eine bekannte DNA-Sequenz. Es kann verwendet werden, um Nukleotide in großem Maßstab zu ersetzen, zu löschen oder einzufügen.

Die Anwendungen der ortsgerichteten Mutagenese werden nachstehend beschrieben.

1. Untersuchung der Struktur, Funktion und katalytischen Eigenschaften von Proteinen
2. Zur Verbesserung der Eigenschaften von Proteinen (Protein Engineering)
3. Einführung oder Entfernung von Restriktionsendonucleasen-Sites.

Wie man Primer für die ortsgerichtete Mutagenese entwickelt

Ortsgerichtete Mutagenese ist ein Prozess der Einführung der gewünschten Mutation mittels eines Primers. Die Mutation kann eine Substitution, Insertion oder Deletion sein. Da die Spezifität der PCR mit zunehmender Fehlpaarung im Primer abnimmt, kann die herkömmliche PCR nur eine oder zwei Basenpaaränderungen in die Zielsequenz einführen. Andere Methoden, wie Primer-Extension und inverse PCR, können zur Einführung von Mutationen im großen Maßstab verwendet werden. Das Primer-Design für die ortsgerichtete Mutagenese ist in gezeigt Figur 2.

Abbildung 2: Primer für die ortsgerichtete Mutagenese

Auswechslung

Bei Substitutionen sollte einer der beiden Primer die gewünschte Mutation in der Mitte des Primers enthalten. Hier bindet die Stelle, die die Mutation enthält, nicht an die Zielsequenz, da sie eine Verzerrung bildet.

Streichung

Bei Deletionen kann die Sequenz, die aus dem Target gelöscht werden soll, während des Primer-Designs vernachlässigt werden. Da diese Sequenz durch Primer von der flankierten Region getrennt ist, würde sie während der PCR nicht amplifiziert werden.

Einfügung

Für Insertionen wird die hinzuzufügende Sequenz während des Primer-Designs mit dem 5'-Ende eines der Primer verschränkt. Daher kann die eingefügte Sequenz auch an das Amplikon gebunden bleiben.

Fazit

Ortsgerichtete Mutagenese ist eine Technik, die zum Einführen von Mutationen in eine DNA-Sequenz verwendet wird. Diese Mutationen können Substitutionen, Einfügungen oder Deletionen sein. Mutationen im kleinen Maßstab können in die herkömmliche PCR eingeführt werden. Mutationen im großen Maßstab können in die Primer-Extension oder in die inverse PCR eingeführt werden. Die Einführung der Mutation erfolgt durch Einbau der gewünschten Mutation in den Primer. 

Referenz:

1. "Methoden für die ortsgerichtete Mutagenese." INTEGRIERTE DNA-TECHNOLOGIEN, Hier verfügbar.

Bildhöflichkeit:

1. "Site Directed Mutagenesis" Von Knbusby - Eigene Arbeit (Public Domain) über Commons Wikimedia