So machen Sie eine stabile transfizierte Zelllinie

Stabile Transfektion ist die langfristige Einführung fremder DNA in Zellen. Stabil transfizierte Zellen leiten die Fremd-DNA durch die Nachkommenschaft. Deshalb, Um stabil transfizierte Zelllinien herzustellen, muss fremde DNA in das Genom der Zelllinie integriert werden. Eine stabile Vererbung kann jedoch auch in nichtgenomischer DNA beobachtet werden. Eine erfolgreiche, stabile Transfektion erfordert effektive Methoden der DNA-Abgabe sowie Selektionsmethoden für Fremd-DNA innerhalb der Zelllinie. Stabil transfizierte Zelllinien werden für einen weiten Bereich von Anwendungen verwendet, wie z. B. für die Herstellung von rekombinanten Proteinen, Genfunktionsstudien, Arzneimittelentdeckungsassays usw..

Wichtige Bereiche

1. So machen Sie eine stabile transfizierte Zelllinie
      - Protokoll zur Erzeugung stabiler Zelllinien
2. So wählen Sie transfizierte DNA in der Zelllinie aus
     - Auswahl einer stabil transfizierten Zelllinie

Schlüsselbegriffe: Episomale Erhaltung, Integration in das Genom, Plasmid, Selektion, Stabil transfizierte Zelllinien

So machen Sie eine stabile transfizierte Zelllinie

Transfektion ist eine Methode des Gentransfers, bei der das genetische Material durch chemische oder nichtchemische Methoden absichtlich in die Wirtszelle eingeführt wird. Es gibt zwei Arten von stabil transfizierten Zelllinien:

1. Der Haupttyp stabiler Zelllinien wird durch die direkte Integration transfizierter DNA in das Genom des Wirtsorganismus erzeugt. Transfizierte DNA wird durch homologe Rekombination in das Genom integriert.
2. Die andere Methode zur Erzeugung stabiler Zelllinien ist die episomale Aufrechterhaltung der transfizierten DNA. Eukaryontische Vektoren werden bei der Transfektion von DNA verwendet, die nicht in das Genom integriert sind. Die Stabilität von episomaler DNA ist jedoch gering. Episomen werden auch nur von bestimmten Arten gehalten. Stabil transfizierte Zelllinien sind in gezeigt Abbildung 1.

Abbildung 1: Stabil transfizierte Zelllinien

Verarbeiten

Die Schritte zur Erzeugung stabiler Zelllinien sind nachstehend beschrieben.

1. Erzeugung einer Abtötungskurve, die die optimale Antibiotikakonzentration für die Auswahl bestimmt - Zellen werden einer zunehmenden Menge an Antibiotikumkonzentration ausgesetzt, um die minimale Antibiotikakonzentration zu bestimmen, die erforderlich ist, um alle Zellen über eine Woche abzutöten.
2. Transfektion von Zellen mit dem gewünschten Plasmidkonstrukt - Das Transfektionsverfahren unterscheidet sich mit dem Typ der Wirtszellen. Liposomenreagenzien werden bei der Transfektion adhärenter Zelllinien verwendet. Zur Transfektion von Suspensionszelllinien werden Elektrotransfektion oder virale Verfahren eingesetzt.
3. Auswahl und Erweiterung stabiler polyklonaler Kolonien - 48-72 Stunden Transfektion werden den Kulturen hohe, optimale und niedrige Konzentrationen an selektiven Antibiotika zugesetzt, um die stabil transfizierten Zelllinien zu erhalten.

So wählen Sie transfizierte DNA in Zelllinien aus

Selektionsmarker werden mit der transfizierten DNA zur Selektion erfolgreich transfizierter Zellen coexprimiert. Das Markergen könnte sich in demselben Vektor (cis) befinden, der zum Transfizieren der Wirtszelle verwendet wird, oder auf einem anderen Vektor (trans). Die Resistenz gegen Antibiotika wie Neomycin, Zeocin, Hygromycin, Puromycin, DHFR usw. kann bei der Selektion verwendet werden. Zusätzlich können transfizierte Gene mit GFP markiert werden.

Fazit

Stabile Zellinien können hauptsächlich durch die Integration transfizierter DNA in das Genom hergestellt werden. Darüber hinaus kann die episomale Aufrechterhaltung von transfizierter DNA auch verwendet werden, um stabile Zellinien für einige Zeit in einigen Wirtsorganismen herzustellen. Es sollte eine Auswahlmethode zur Identifizierung von transfizierter DNA in der Zelllinie vorhanden sein. 

Referenz:

1. "Protokoll der Erzeugung stabiler Zelllinien". Creative BioMart, Hier verfügbar.

Bildhöflichkeit:

1. "Knockout mouse production 2" Von Kjaergaard - Eigene Arbeit (CC BY 3.0) über Commons Wikimedia