Wie man Primer für die PCR herstellt

Primer sind sowohl für die Amplifikation von DNA eine wesentliche Komponente in vivo und in vitro. In vivo, Das Enzym DNA-Polymerase erfordert einen Primer zur Initiierung der DNA-Replikation. In vitro, Primer werden meistens zur Initiierung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt. Einige andere Techniken, einschließlich Sequenzierung, Klonierung, ortsgerichtete Mutagenese usw., erfordern Primer. Daher ist die Gestaltung von Grundierungen für in vitro Techniken werden ziemlich einfach, aber ein schwieriger Prozess für Molekularbiologen. Daher werden in diesem Artikel die Grundregeln für das Primer-Design für PCR und Sequenzierung beschrieben.

Wichtige Bereiche

1. Was ist eine Grundierung?
     - Definition, Typen, Rolle
2. Wie funktionieren Primer in einer PCR?
     - Merkmale der DNA, Prozess der PCR
3. Wie man Primer für die PCR herstellt
     - Grundregeln für das Design von PCR-Primern
4. So entwerfen Sie eine Sequenziergrundierung
    - Eigenschaften von Sequenzierprimern

Schlüsselbegriffe: DNA-Synthese, Forward Primer, Länge, Schmelztemperatur, PCR, Reverse Primer, Sequenzierprimer

Was ist eine Grundierung?

Ein Primer ist ein kurzer DNA- oder RNA-Strang, der als Ausgangspunkt für die DNA-Synthese dient. Die Enzyme, die die DNA-Replikation katalysieren, können Nukleotide an ein vorhandenes 3'-Ende anfügen. Der Primer bildet somit die Grundlage für die DNA-Synthese, indem er als Primzahl dient. RNA-Primer werden innerhalb der Zelle für die Initiierung der DNA-Replikation durch DNA-Polymerase verwendet. Jedoch synthetisch DNA-Primer kann für die Amplifikation von DNA verwendet werden, hauptsächlich durch PCR und andere Techniken. In der PCR werden zwei Arten von Primern verwendet, die als Forward- und Reverse-Primer bekannt sind. Während der PCR können Millionen von Kopien des gewünschten DNA-Fragments hergestellt werden, indem diese bestimmte DNA-Sequenz in der genomischen DNA durch Vorwärts- und Rückwärtsprimer flankiert wird. Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die eine bestimmte DNA-Sequenz flankieren, sind in gezeigt Abbildung 1.

Abbildung 1: Vorwärts- und Rückwärtsprimer

Wie funktionieren Primer in der PCR?

DNA ist ein Molekül mit zwei zusammengehaltenen Strängen. Das Basenpaarmuster ist zu beiden Strängen komplementär. Die beiden Stränge werden durch die Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Stickstoffbasen zusammengehalten. Darüber hinaus hat jeder Strang eine eigene Ausrichtung. Ein Strang hat eine Richtung von 5 'nach 3', während der andere eine Richtung von 3 'nach 5' hat. Daher sind die beiden Stränge antiparallel. Der Strang mit der Richtung 5 'nach 3' ist als Sensestrang bekannt, während der Strang mit der Richtung 3 'nach 5' als der Antisense-Strang bekannt ist. Jeder der beiden Stränge sollte während der PCR einzeln synthetisiert werden.

Die drei Schritte der PCR sind Denaturierung, Annealing und Verlängerung. Bei der Denaturierung werden die beiden DNA-Stränge durch Aufbrechen der Wasserstoffbrücken durch Erhitzen auf 95 ° C getrennt. Der Vorwärtsprimer bindet an den Sense-Strang, während der Rückwärtsprimer an den Antisense-Strang bindet. Das Tempern der Primer erfolgt, wenn die Temperatur von 95 ° C auf 50–60 ° C sinkt. Somit können beide Stränge gleichzeitig mit Hilfe von hergestellt werden Taq Polymerase. Die Verstärkung sowohl der Sense- als auch der Antisense-Stränge erfolgt in 5'-Richtung. Da es sich bei der PCR um eine exponentielle Reaktion handelt, werden die drei Schritte in 25-35 Zyklen wiederholt. Sowohl Vorwärts- als auch Rückwärtsprimer werden in jedem Zyklus verwendet, um etwa 2 zu erzeugen³⁵ Kopien des gewünschten DNA-Fragments. Die Rolle von Primern bei der PCR ist in gezeigt Figur 2.

Figur 2: PCR

Wie man Primer für die PCR herstellt

Um ein bestimmtes DNA-Fragment im Genom zu amplifizieren, sollte dieses bestimmte DNA-Fragment sowohl von Vorwärts- als auch von Rückwärts-Primern flankiert werden. Daher sollten beide Primer komplementär zu den Sequenzen sein, die das DNA-Fragment flankieren. Die grundlegenden Richtlinien für das erfolgreiche Design von PCR-Primern werden im Folgenden beschrieben.

1. Die Richtung von Vorwärts- und Rückwärtsprimer sollte 5 'bis 3' betragen..
2. Die Länge jedes Primers sollte zwischen 18 und 25 Nukleotiden betragen.
3. Der GC-Gehalt der Primer liegt zwischen 40 und 60% und die Anwesenheit von C oder G am 3'-Ende des Primers kann die Bindung fördern.
4. Die Schmelztemperatur und Tm (die Temperatur, bei der die Hälfte des Primers an das Templat angelagert ist) des Primerpaares sollten ähnlich sein und über 60 ° C liegen. Die maximale Differenz sollte 5 ° C betragen.
5. Das 3'-Ende des Primers sollte genau mit der Template-DNA übereinstimmen.
6. In den letzten 5 Basen am 3'-Ende des Primers sollten mindestens 2G- oder C-Basen (GC-Clamp) vorhanden sein. Die GC-Klammer fördert eine starke Bindung an die Zielsequenz.
7. Restriktionsstellen mit 5-6 Nukleotiden können an das 5'-Ende des Primers angefügt werden.
8. Die Dinukleotid-Wiederholungen (ATATATAT) oder Wiederholungen desselben Nukleotids mehr als viermal (ACCCC) sollten in den Primersequenzen vermieden werden. Dies führt zu Fehlanreizen.
9. Intra-Primer-Homologie oder Sekundärstrukturen von Primern sollten vermieden werden. Eine Inter-Primer-Homologie oder komplementäre Sequenzen in den Vorwärts- und Rückwärts-Primern sollten vermieden werden. Beide Bedingungen können Selbstdimere oder Primer-Dimere bilden.
10. Der ΔG-Wert für die Dimeranalyse sollte zwischen 0 und -9 kcal / Mol liegen.

Für das einfache Design des Primers stehen viele Online-Tools zur Verfügung, wie Primer 3, Primer X, NetPrimer, DNAstrar usw. Die Spezifität der entworfenen Primer kann mit Tools wie NCBI Primer-BLAST oder UCSC in-silico-PCR bestimmt werden. 

Abbildung 3: Primer 3-Schnittstelle

So entwerfen Sie eine Sequenziergrundierung

Sequenzierprimer sind, genau wie PCR-Primer, kurze DNA-Stränge. PCR-Primer sind jedoch für die Amplifikation eines bestimmten DNA-Fragments ausgelegt, während Sequenzierungs-Primer verwendet werden, um die Nukleotidsequenz des amplifizierten DNA-Fragments durch PCR aufzudecken. Im Gegensatz zu PCR-Primern kann bei der Sequenzierung ein einzelner Primer verwendet werden, wenn nur die Zielsequenz eine Länge von weniger als 500 bp hat. Als Beispiel kann der Vorwärtsprimer der PCR bei der Sequenzierung verwendet werden, um nur den Erfassungsstrang zu amplifizieren. Darüber hinaus ist der Grad der Fehlpaarungen, die während der Sequenzierungsreaktion toleriert werden, höher als bei der PCR. Im Allgemeinen sind PCR-Primer komplementär zur Zielsequenz. Einige Sequenzierungsprimer stehen jedoch nicht in Beziehung zur Zielsequenz. Sie sind als Universalprimer bekannt. Universal-Primer wie T7 oder SP6 werden an den Vektor gebunden, der die Zielsequenz trägt. Sie können sowohl für verschiedene Vektoren als auch für verschiedene Arten von DNA-Fragmenten verwendet werden.

Fazit

Primer werden bei der PCR und Sequenzierung zur Initiierung der DNA-Synthese verwendet. Zwei Arten von PCR-Primern können als Vorwärts- und Rückwärtsprimer identifiziert werden. Forward-Primer gehen an den Sense-Strang, während Reverse-Primer an den Antisense-Strang anlagern. Bei der Sequenzierung kann entweder ein Vorwärts- oder ein Rückwärts-Primer verwendet werden, um das Ziel zu amplifizieren. Beim Design von Primern sollten viele Faktoren wie Primerlänge, Tm und GC-Gehalt berücksichtigt werden. Es stehen viele Online-Tools zur Verfügung, mit denen Primer für eine bestimmte Sequenz entworfen werden können.

Referenz:

1. „Primer Design: Tipps für einen effizienten Prozess.“ Genome Compiler Corporation, 3. November 2015, erhältlich hier.
2. „Primer und Primer-Design für die Sequenzierung“. Primer und Primer für das Sequenzieren, University of Calgary, hier erhältlich.

Bildhöflichkeit:

1. “Primers RevComp” von Zephyris - Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia
2. "Polymerase-Kettenreaktion" von Enzoklop - Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia