Unterschied zwischen PCR und RT PCR

Hauptunterschied - PCR vs. RT-PCR

PCR und RT-PCR sind zwei wichtige Techniken in der Molekularbiologie. PCR wurde in den 1980ern von Kary Mullis entwickelt. Es ist in der Lage, die Anzahl von Kopien eines bestimmten Gens exponentiell zu erhöhen, wodurch der Nachweis dieses bestimmten DNA-Fragments erleichtert wird. Taq Polymerase ist das am häufigsten in PCR-Systemen verwendete Enzym. Es ist ein thermostabiles Enzym. Bei der RT-PCR folgt der reversen Transkription die PCR. Das Enzym Reverse Transkriptase ist an der Synthese komplementärer DNA aus RNA beteiligt. Das Hauptunterschied zwischen PCR und RT-PCR ist das Die PCR verwendet doppelsträngige DNA als Template, während die RT-PCR RNA als Template verwendet.

Wichtige Bereiche

1. Was ist PCR?
      - Definition, Prozess, Anwendung
2. Was ist RT-PCR?
      - Definition, Eigenschaften, Anwendung
3. Was ist der Unterschied zwischen PCR und RT PCR?
      - Vergleich der wichtigsten Unterschiede

Schlüsselbegriffe: PCR, RT-PCR, Polymerase-Kettenreaktion, Umkehrtranskriptions-Polymerase-Kettenreaktion, DNA-Schablone, DNA-Polymerase, Denaturierung, Annealing, Primer-Erweiterung

Was ist PCR?

PCR (Polymerase Kettenreaktion) ist eine relativ einfache, aber revolutionäre Methode. Die PCR nutzt die Fähigkeit des Enzyms DNA-Polymerase, um neue DNA-Stränge komplementär zum angebotenen Template-Strang zu synthetisieren. PCR ist eine unverzichtbare Technik, die sowohl in klinischen Labors als auch in Forschungslaboratorien zur funktionellen Analyse von Genen, zur Diagnose und Überwachung von Erbkrankheiten, zum DNA-Klonieren, zur Sequenzierung und zur alten DNA-Amplifikation verwendet wird. DNA-Template, Nukleotide, Primer und DNA-Polymerase sind die vier Hauptkomponenten der PCR. Das DNA-Vorlage ist in der Regel eine doppelsträngige DNA mit der Zielsequenz, die amplifiziert werden soll. Taq DNA-Polymerase welches ist isoliert von Thermus Aquatics wird üblicherweise in der PCR verwendet. Das Pfu DNA-Polymerase ist eine andere Art von DNA-Polymerase mit hoher Genauigkeit. Beide Taq und Pfu Polymerasen sind hitzebeständig. Die von den DNA-Polymerasen hinzugefügten Nukleotide sind Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Da DNA-Polymerase nur ein neues Nukleotid an ein 3'-Ende eines bereits vorhandenen DNA-Strangs anfügen kann, ist für die Initiierung der DNA-Synthese ein Oligonukleotid-Primer erforderlich. Das Erfordernis eines Primers in der PCR ermöglicht die Abgrenzung nur einer bestimmten Region in der Vorlage. Die Zielsequenz wird von Vorwärts- und Rückwärtsprimern flankiert. Am Ende einer PCR werden neue Kopien, so genannte Amplicons einer bestimmten DNA-Sequenz, in Milliardenhöhe angesammelt. Die Komponenten der PCR sollten so optimiert werden, dass die PCR-Leistung verbessert und gleichzeitig der Ausfall minimiert wird.

PCR ist ein automatisierter Prozess, der von Thermocyclern ausgeführt wird, die zwischen verschiedenen Temperaturen wechseln können. PCR ist ein dreistufiger Prozess.

1. Denaturierung - Die doppelsträngige DNA-Matrize wird durch Erwärmen auf 94–95 ° C in zwei Einzelstränge getrennt.
2. Glühen - Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer binden an die komplementären Sequenzen im Template. Die Temperatur dieser Stufe hängt von der Schmelztemperatur der Primerkombination ab.
3. Primer Erweiterung - Das DNA-Polymerase-Enzym verlängert jeden der Primer an seinem 3'-Ende, indem es dem wachsenden Strang komplementäre Basen hinzufügt. Die optimale Temperatur von Taq Polymerase, 72 ° C wird als Temperatur im Verlängerungsschritt verwendet. Der Zeitpunkt der Verlängerung hängt von der Anzahl der Basenpaare im Schablonenstrang ab.         

Die drei Schritte werden 28-35 Mal wiederholt.

Abbildung 1: Polymerase-Kettenreaktion

Die Produkte der PCR werden durch Agarosegelelektrophorese im Vergleich zu einer DNA-Leiter größenfraktioniert. Die Sichtbarmachung der DNA auf einem Agarosegel erfolgt durch Anfärben mit Ethidiumbromid und Beobachten unter UV-Licht. Die amplifizierten DNA-Banden unter UV in einem mit Ethidiumbromid gefärbten Gel sind in gezeigt Figur 2. Die DNA-Leiter ist im linken Bereich dargestellt.

2: DNA-Banden

Was ist RT-PCR?

RT-PCR (Reverse Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion) ist eine der empfindlichsten Techniken zum Nachweis von mRNA. RNA ist die geeignete Vorlage zum Sammeln von Informationen entweder zur Genexpression eines normalen Gewebes oder zur Genexpression eines infizierten Gewebes. Das Template für die RT-PCR kann entweder Gesamt-RNA oder virale oder bakterielle RNA sein. RNA wird durch das Enzym reverse Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) revers transkribiert. Die optimale Temperatur der reversen Transkriptase beträgt 46 ° C. Die cDNA wird in der PCR verwendet, um das Produkt zu erhalten. Schritte in der reversen Transkriptions-PCR sind in gezeigt Figur 3.

3: RT-PCR

Die RT-PCR kann in zwei oder einstufigen Reaktionen durchgeführt werden. In der zweistufigen Reaktion werden die reverse Transkription und die PCR in zwei getrennten Schritten durchgeführt. Bei der einstufigen RT-PCR folgt der reversen Transkription die PCR in einem einzelnen Röhrchen auf sequentielle Weise. Sowohl die cDNA als auch das PCR-Endprodukt können zur Größenfraktionierung und zur Visualisierung auf einem Agarosegel laufen gelassen werden. Einstufige und zweistufige RT-PCR sind in gezeigt Figur 4.

Abbildung 4: Einstufige und zweistufige RT-PCR

Unterschied zwischen PCR und RT-PCR

Definition

PCR: PCR ist eine Technik, die in der Molekularbiologie verwendet wird, um ein DNA-Segment zu amplifizieren, das Millionen von Kopien einer DNA-Sequenz erzeugt.

RT-PCR: RT-PCR ist eine Variante der PCR, die zum Nachweis der Genexpression in der Molekularbiologie verwendet wird.

Schritte

PCR: Denaturierung, Annealing und Extension sind die drei Schritte der PCR.

RT-PCR: Bei der RT-PCR folgt der reversen Transkription die PCR. 

Vorlage

PCR: Ein doppelsträngiges DNA-Molekül dient als Vorlage für die PCR.

RT-PCR: Ein einzelsträngiges RNA-Molekül dient als Vorlage für die reverse Transkription. Ein einzelsträngiges DNA-Molekül dient als Vorlage für die PCR.

Verwendete Enzyme

PCR: DNA-Polymerase wird als Enzym bei der PCR verwendet.

RT-PCR: Reverse Transkriptase und DNA-Polymerase werden als Enzyme bei der RT-PCR verwendet.

Grundierungen

PCR: In der PCR werden Forward- und Reverse-Primer verwendet.

RT-PCR: Für die reverse Transkription wird nur der Reverse-Primer verwendet, und für die PCR werden sowohl Forward- als auch Reverse-Primer verwendet.

Empfindlichkeit

PCR: PCR ist eine empfindliche Methode.

RT-PCR: RT-PCR ist empfindlicher als PCR.

Anwendungen

PCR: PCR wird bei der funktionellen Analyse von Genen, bei der Diagnose und Überwachung von Erbkrankheiten, beim DNA-Klonen, bei der DNA-Sequenzierung und bei der DNA-Amplifikation verwendet.

RT-PCR: RT-PCR wird zum Nachweis der Genexpression verwendet.

Fazit

PCR und RT-PCR sind zwei der wichtigsten in der Molekularbiologie verwendeten Techniken. Sowohl PCR als auch RT-PCR sind automatisierte Techniken, die in der Lage sind, die Anzahl der Kopien einer Ziel-DNA-Sequenz, die durch die Vorwärts- und Rückwärts-Primer definiert ist, exponentiell zu erhöhen. Bei der PCR wird doppelsträngige DNA als Template verwendet. Durch PCR können DNA-Klonierung, DNA-Sequenzierung und funktionelle Analyse der Gene durchgeführt werden. Bei der RT-PCR kann die Genexpression in einem bestimmten Gewebe durch Amplifizieren von RNA beobachtet werden. Der Hauptunterschied zwischen PCR und RT-PCR besteht in ihren Templates, die in jeder Reaktion verwendet werden, und in ihren Anwendungen.   

Referenz:

1. ”Polymerase Chain Reaction (PCR)”. Nationales Zentrum für Biotechnologie Information. US National Library of Medicine, n. D. Netz. Hier verfügbar. 1. Juni 2017.
2. "Polymerase-Kettenreaktion (oder PCR)". Klonierung und molekulare Analyse von Genen. N.p., n. D. Netz. Hier verfügbar. 1. Juni 2017. 
3. Biolabs, New England. "CDNA-Synthese & RT-PCR." CDNA-Synthese & RT-PCR | NEB. N.p., n. D. Netz. Hier verfügbar. 1. Juni 2017.

Bildhöflichkeit:

1. ”Polymerase-Kettenreaktion” von Enzoklop - Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia
2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis". Von Rainis Venta - Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia
3. "Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion" Von Jpark623 - Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia
4. "Ein-Schritt vs. Zwei-Schritt-RT-PCR" Von Jpark623 - Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia